单克隆分离与挑选.docxVIP

单克隆的分离与挑选 1.在正式开始工作前 1-7 天时间内准备好：将菌种 mm294 在 LB 琼脂培养基的 平板上划线，和将 mm294 /含氨苄西林抗性基因的菌种在 LB 琼脂和氨苄西林的 培养基的平板上划线。将其在 37 oC 下培养过夜。培养好后将平板，用封口膜 或者塑料膜包起来放置在 4℃并干燥的环境中。 2.实验准备: 2 个 LB 琼脂平板 2 个 LB 氨苄西林的平板 3.在平板的底部做上清晰的标记，（不要写在盖子上）。 4.在 37℃下预热 材料： 培养的菌和平板 2 个 LB 琼脂平板 袋  支持和仪器 含有 10%漂白粉的垃圾 2 个 LB 氨苄西林的平板 培养好的 mm294LB 琼脂平板 培养好的 mm294/氨苄西林 LB 氨苄西林的平板  或者其他的消毒措施 实验用煤气灯 接种环 记号笔 平板划线技术： 在平板上写上你的标记和日期用记号笔，每个平板都预先写上 LB 琼脂或者 LB 琼脂+氨苄西林 选择两个 LB 琼脂平板，一个标记-PAMP(氨苄阴性)细菌不含质粒，另一个标记 +PAMP(氨苄阳性)细菌含质粒。 选择两个 LB 琼脂+氨苄西林平板，一个标记-PAMP(氨苄阴性)细菌不含质粒， 另一个标记+PAMP(氨苄阳性)细菌含质粒。 像握铅笔一样握住接种环，在灯上烧接种环，烧到环呈红热状态，然后继续 烧下半部分。 放凉 5 秒，不要把接种环放在试验台上避免被污染。 大肠杆杆菌的一种划板技术 从培养平板开始： 用另一只手移动培养有 E。Coli 的平板的盖子，不要将盖子放在试验台上，盖 子面朝下对着培养平板，防止污染物落入平板中。 把接种环在平板干净的地方刺几下使其冷却。 C  用接种环刮取一个可见的菌团作为一个克隆，不要刮烂琼脂层。更换一个新 的培养皿盖，按照步骤 7 进行。 7.选一个 LB-PAMP 平板，打开盖子一点一点，只要足够划线就可以。 划线 1：划动接种环的前端向琼脂层表面划线。并使划线遍及平板的顶部， 避免划烂琼脂层。 划线 2：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离第一次的划线。 接种环通过第一次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约占整 个平板表面的 1/4. 划线 3：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前两次次的划 线。接种环通过第二次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约 占整个平板表面的 1/4，且锯状线不要再接触到前面划的线。 划线 4：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前三次的划线。 接种环通过第三次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其仍然能 占到整个平板表面的 1/4。 重复 4-7 的过程，把 E.coli 接种到平板 LB/amp，-PAMP（氨苄阴性）。 重复 4-7 的过程，把 E.coli/PAMP 接种到平板 LB，+PAMP（氨苄阴性）。 重复 4-7 的过程，把 E.coli/PAMP 接种到平板 LB/amp，+PAMP（氨苄阴性）。 重新烧接种环，并使它冰凉后放在接种工作台上，最后一次使用要烧接种环， 保持这个好习惯。 把平板颠倒放在 37℃培养箱中，培养 15-20h。（平板倒过来放是为了防止凝 结产生的水掉落在琼脂层上引起菌板移动） 选择达到预期效果的单克隆，培养了 15-20h。这时单克隆的直径 0.5mm- 3mm。 14 卫生处理 将废弃的菌，消毒处理。