PCR原理及检测方法解读 .pptVIP

4. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.2 ～ 1 μM 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl 1U / 25 ～ 50μl 偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低 6. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 bp DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl 过高：非特异产物增加 过低：产量降低 7. 水： 去离子水，补足整个反应体积。 四、PCR反应体系： 各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。 五、PCR反应条件优化： 1、温度、循环参数： ⑴ 变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。 加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。 ⑵ 复性温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。 复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。 复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。 一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板之间完全结合。 ⑶ 延伸温度和时间： 一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， 1Kb，1分钟足够； 1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。 延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃ 1′。 ⑷ 循环数： 其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。 理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20 ～ 30次是比较合理的循环次数。 循环次数越多，非特异扩增增加。 六、PCR扩增产物的分析 常用琼脂糖凝胶电泳 上排： 1：marker 2：阴性对照 3-17： 标本（引物为CA16） 下排： 1-3： 标本（引物为CA16） 4：CA16引物的阳性对照 5：marker 6：阴性对照 7-14：标本（引物为EV71） 15：EV71引物的阳性对照 RT-PCR技术 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。 Real-Time PCR技术 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。 当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近