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-2-3 -4 -2 -3 -4 -5 -2 -3 -3 -5 -5 -4 -5 -4 土壤中放线菌的分离 实验目的：1 掌握配制合成培养基的一般方法。 2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、KNO 3 、NaCl、K 2 HPO 4 ?3H 2 O、MgSO 4 ?7H 2 O、FeSO 4 ?7H 2 O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫 酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配 制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为 KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、 有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体， 为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯 培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基 或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理 1h），或加入某种抑制剂 （如加数滴 10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过 稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉 20g，硝酸钾 1g,氯化钠 0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂 20g，水 1000ml，pH7.2～7.4。 配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分， 溶化后，补足水分至 1000ml。112℃灭菌 20 分钟。 2. 土壤中放线菌的分离 （1）待测样液的制备 选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约 2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取 2～10cm 处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将 5 点样品 约 1kg 充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。 称土样 1g 于盛有 99mL 无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡 10～20min， 使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为 10 浓度的菌悬液，静置 30s。另取装有 9ml 无菌 水的试管 3 支，编号 10 、10 、10 。用无菌吸管无菌操作取 10 浓度的土壤悬液 1ml 并加入编号 10 的无菌试管中，并吹吸吸管 2~3 次，使与 9ml 水混匀，即为 10 浓度的土壤稀释液。依此类推， 直到稀释至 10 的试管中（每个稀释度换 1 支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下 进行。 （2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌 取 2 支 1 毫升移液管分别从 10 、10 菌悬液中吸取 1 毫升菌悬液，分别注入编号 10 、10 的培养皿内。将温度为 45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分 混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌 落。 -4 -5-5-4 -4 -5 -5 -4 -2 （3）涂布平板法分离土壤中放线菌 取 2 套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10 、10 ）、组别、姓名、操 作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至 50℃左右的高氏一号培养 基 15~20ml 左右，待冷凝成平板。 用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取 0.1ml 加到一组相应编号（10 ）的高氏一号平 板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），再依次将 10 的土壤稀释液加到相应平板上。用 无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。 （4）平板划线法分离土壤中放线菌 取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基 10～12 毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿 底用蜡笔划分 A、B、C、