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土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯 种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、 KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸 钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、 三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、 酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉 菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性 好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物 的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生 物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用 稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合 成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理 （120℃热处理 1h），或加入某种抑制剂（如加数滴 10%酚等），都可 以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通 过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌 株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡 萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用 化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基： 碳源为可溶性淀粉、氮源为 KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO  4  ?7H  2  O 作为无机盐，FeSO  4  ?7H  2  O 作为微生物的微量元素，提 供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉 5g，硝酸钾 0.25, MgSO4?7H2O0.125g， FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠 0.125g，琼脂 5g，水 250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌 水至 250ml，调节 pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后， 121℃灭菌 20 分钟。 -3、 -4 -5 -3、 -4 -5 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -1 -1 -2 -5 将 6 套平皿、12 只试管灭菌。 2. 土壤中放线菌的分离 1．编号，分装：取 6 套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤 稀释液的稀释度（10 10 、10 ）。每个稀释度做两个培养皿。然 后在每皿中倒入已溶化并冷凝至 50℃左右的高氏一号培养基 15~20ml 左右，待冷凝成平板。　 另取 5 支盛有 9ml 一只盛有 10ml 无菌水的试管，排列于试管架 上，依次标明 10 、10 、10 、10 、10 、10 。 　2．稀释倾注分离 　称 1g 土样放入 10ml 无菌水试管中振荡 10min，即 10 的土壤 悬液，静置 30s。 用无菌吸管无菌操作取 10 浓度的土壤悬液 1ml 并加入编号 10  -2 的无菌试管中，并吹吸吸管 2~3 次，吸时伸入管底，吹时离开水面， 使其混合均匀。即为 10 浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释 至 10 的试管中（每个稀释度换 1 支无菌吸管）。 如图 -4 -4 -5 -6 　　 　3．倒平板分离培养 于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至 45℃ 左右的高氏培养基约 10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝 固。（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。 ） 　　用 1ml 无菌吸管分别精确地吸取 10 、10 、10 的稀释菌液 1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用 无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液 在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。 稀释涂布平板法 　4 培养  接种完毕，将平皿和试管放入 28℃恒温箱培养 7 天， 观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。 菌种纯化 1、倒平板  将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。 2、平板划线 划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列 二种： 图Ⅴ-3 划线分离示意图 ⑴分区划线  用接将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态， 在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁刮 取少许菌苔，在平板培养基的一边，作第 1 次平行划线 6～7 条