《生物信息学》12蛋白质结构测定和分析.pptx

第10讲 蛋白质结构测定和分析李少伟Dec.18th,2013 ;背景;Why protein structures?;各种蛋白质原子结构：解释了生命的本质;;蛋白质相互作用;;生物大分子三维结构研究方法： 核磁共振波谱学 X-射线晶体学 低温电镜技术;核磁共振波谱学(NMR);测定生物大分子结构重要手段;具有不同结构特征的原子核间距、肽键二面角、肽键的动态特性等都具有特征的核磁共振谱线； 1H,13C,15N是核磁共振检测的主要对象,各有不同的共振频率,从而形成核磁共振氢谱、碳谱和氮谱三部分； NMR 不破坏被测样品的内??结构，是一种无损检测方法。;核磁共振谱仪的组成;1985 年,维特里希( Kurt Wüthrich）等人公布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白质-蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的结构； 目前,科学家已经利用这一方法绘制出15 %～20 %的已知蛋白质的结构； 它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域 ;直接在溶液中测定自然状态下的大分子三维空间结构，其分辨率已接近0.12nm ； 它只能测量分子量较小(15-25kDa)的生物分子，最大可测定35kDa 的生物分子;X－射线晶体学;;;X-射线的产生;X-射线发生方法;同步辐射;蛋白质晶体;;晶体的产生—结晶相;;有关结论汇总： 对称元素：10，26 空间群：230 点群：32 晶系与晶胞参数类别：7 平移群：14 空间点阵类别：P，C，I，F。;结晶常用方法;X-射线与晶体的关系;衍射和干涉;X-射线+晶体;;X-ray 360°衍射图：;…… 各种方法获得初始相角并改善其品质;关键问题：相位解决;f(x) = A cos(2px – a);;解决相位问题的方法： ? 同晶置换法 最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍射数据。 ? 反常散射法 包括多波长反常散射法和单波长反常散射法。通常需要引入具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多颗晶体但往往需要同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常散射源。 ? 分子置换法 需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体，不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。;低温电镜技术;透射电子显微镜技术;透射电子显微镜技术;透射电子显微镜技术;低温透射电子显微镜技术;生物样品为什么需要低温：;为什么需要低温：冷冻超薄切片举例;为什么需要低温：冷冻负染举例;低温样品制备Vitrobot - Vitrification Robot;Cryo-holder workstation;Cryo-holder workstation;From Lake (1972), p.174;提纯样品;;Icosahedral Particle Image Reconstruction Scheme ;Icosahedral Virus 3D Reconstruction Scheme;;;Specifying Direction of View: ??,f????Orientation;5 parameters to describe a boxed particle: 3 rotational angles: q, f and w in degrees 2 translational parameters: x, y in pixels ;结构与功能示例(RIG-1);Structure.2010, 18:894;;结构与功能示例(RSV);Pre-fusion protein复合物的空间结构;Pre-fusion protein和post-fusion protein的结构比较;fusion protein的表位－新疫苗设计的重要信息;思考题