甘油菌活化和质粒提取.docxVIP

一、甘油菌活化 1. LB 培养基制备： 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl10g 加去离子水至 800mL 搅拌，使溶质完全溶解，用 5mol/LNaOH（约 0.2ml）调节 PH 至 7.4，加入去离子水至 1000ml，高压蒸汽灭菌 20min。 灭菌后注意密封，4℃能存放 1 个月。 含琼脂的 LB 培养基： 上述液体培养基高压灭菌前加入 15g/L（铺制平板用）或 7g/L（配制顶层 琼脂糖用）琼脂糖，高压灭菌 20min。 2.倒平板 2.1 超净台，接种环，灭菌培养皿，酒精灯等紫外灭菌 30min。 2.2 培养基高压后放在 60℃水浴锅中保温。溶液尚未冷却时，即应取出培 养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中。 小心培养基过热，旋动液体产生暴沸。 2.3 冷却至 50℃，在超净台中加入抗生素等不耐热的物质（现用现加），为 避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式，然后直接从烧瓶中倾出培养 基铺制平板。 2.4 从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上，不要等到融化（反复冻溶不利 于长期保存），直接用（枪头）接种环在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂 平板即可。 37℃培养 12-16h。第二天挑单克隆大量培养。 3.大量培养 3.1 生素。 3.2 冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌，待冷却至 50℃左右加入抗 在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中（2-5mL）， 37℃，200rpm 培养 8h。 3.3 按 1:500 至 1:1000 的比例，用加抗生素的液态 LB 培养基稀释 3.2 所得 菌液。 （25-50uL 菌液+25mL 液态含抗生素 LB 培养基）。37℃，200rpm 培养 12- 16 小时。 ? 使密度达到 3-4?10^9/mL。 ? OD  600 在 0.5 左右。（在可见分光光度计 600nm 处测菌液的光密度值， OD600 在 0.5 左右时可判断细胞处于对数生长期，活力最佳。） 二、质粒提取 1. 准备工作 1.1 RNaseA 用前瞬离。一小瓶 RNaseA 加到 1 瓶 buffer P1 中，使终浓度 为 100ug/mL。 ? Optional:按 1:1000 的比例，在 bufferP1 中加入 LyseBlue。 1.2 检查 buffer P2 是否有沉淀（SDS,低温环境），如果有沉淀，将 P2 放置 37℃条件下，以使沉淀溶解。 3 4℃预冷 bufferP3。 质粒提取 2.1 上述菌液，6000?g，4℃离心 15min，收集沉淀。 ? 若不马上进行实验，沉淀可-20℃保存 2.2 用 QIAGEN 质粒提取试剂盒中的 4mL buffer P1 重悬。 为使裂解充分，容器要足够大，使充分混匀 确保 buffer P1 中已加入 RNaseA 如果 bufferP1 中加了 LyseBlue，重悬菌液之前，应将混合液 （bufferP1+LyseBlue）用力混匀 ? 涡旋或上下颠倒混匀，使重悬菌液无团块 2.3 5min。 加入 4mL buffer P2，颠倒混匀 4-6 次，室温（15-25℃）静置反应 千万不可用振荡器混匀，会使 DNA 链断裂 静置时间不要超过 5min Buffer P2 用后立即密封，以防空气中的 CO2 使其酸化 此时裂解菌液应是粘稠的 如果 buffer P1 中加入了 LyseBlue，那么加入 buffer P2 并混匀后，应出 现均匀的蓝色，如果出现局部无色或棕色团块，应继续颠倒混匀 2.4 加入 4mL 预冷 bufferP3，立即用力颠倒混匀 4-6 次，冰上静置 15min。 ? 注意低温操作（预冷，冰上静置），目的是促沉淀 加入 bufferP3 后，出现白色蓬松状沉淀，沉淀为基因组 DNA，蛋白质， 细胞碎片，KDS。此时，裂解液粘稠度应降低 如果 buffer P1 中加入了 LyseBlue，沉淀过滤后，溶液应该是无色的， 表明 SDS 已经充分沉淀 2.5 离心前混匀，≥20000?g，4℃离心 30min。快速吸取上清（含质粒）。 2.6 上清≥20000?g，4℃离心 15min。吸取上清。 ? Optional:取 240uL 上清，做凝胶电泳分析，以判断培养和分离是否合 理 2.7 平衡 QIAGENtip-100，向 QIAGENtip-100 中加入 4mL bufferQBT，重 力作用自然流下。 2.8 将 2.6 中的上清加入 2.7 平衡过的 QIAGENtip-100 中。 提前平衡 QIAGENtip-100，使得上清尽快加入，如果间隔时间太久， （蛋白沉淀变混浊）应再次离心以免堵塞 QIAGENtip-1