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靶向PCR CTC检测技术 ——帮助临床医生更全面地评估肺癌 Lung Cancer in Solid Tumor in China = ？ 液态活检 通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤 病理活检 通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤 CTC ctDNA mircoRNA LNC RNA Others 传统的组织细胞学检测 液态活检在肺癌中的应用 治疗策略 事件 疑似肺癌 辅助诊断 早癌肺癌 晚期肺癌 癌症耐药 复发监测 治疗方案选择 耐药机理 新药研发 CTC的临床应用价值 疗效评估 CTC(数量） (负向富集+靶向PCR） ctDNA (基因变异） 1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015 什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？ 肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态 CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1 CTC≠有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2 什么时候可以检测到CTC？ 早期肿瘤外周血中即可检出CTC W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007 早期肿瘤外周血中即可检出CTC 表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞 移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升 在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象 CTC富集技术 密度与大小 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集) 微流体 CTC检测方法 CTC检测技术 靶向PCR 免疫荧光 普通PCR = + “方法” “收获” “垃圾” 蟹饵 没水了， 我们躲不了了 放 水 负向富集 优势：回收率100% 劣势：纯度略低 幸好没贪嘴， 我们逃了 “方法” “收获” “垃圾” 没水了， 我们躲不了了 放 水 负向富集 优势：回收率100% 劣势：纯度略低 幸好没吃胖， 我们逃了 网 筛 CTC检测技术 检测原理 负向富集 靶向PCR FR阳性靶标 肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达 CTC：FR=1:50万 EMT转化不影响FR丰度 其他血细胞不表达FR CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自动化 灵敏度超高，负向富集可满足检测要求 信号二次放大，1个CTC信号放大10^12倍 无需人工经验判读，结果客观准确 可实现CTC的定量 CTC检测靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性 1个CTC信号放大1012倍 CTC检测 优势一：阴性富集不丢失循环肿瘤细胞 优势二：靶向探针特异性高 优势三：PCR扩增信号，确保高敏感性 优势四：PCR仪判断CTC技术，避免人为误差 3mL血 1mL/3mL血 3mL血 1个CTC/3mL血 50万FR/1个CTC 1个CTC/1slide 100万信号/1个FR 1个信号/1个CTC FR靶向PCR—— 1个CTC细胞信号方法10^12倍（万亿倍） 细胞免疫荧光—— 1个CTC细胞信号几乎没有放大 Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定 16 EpCAM – 上皮细胞粘附分子 APC – 异藻蓝蛋白荧光染料 CK – 细胞角蛋白 PE – 藻红蛋白荧光染料 DAPI – 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料） EpCAM阴性细胞中，存在大量CTC Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做为探针 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTC Jiatao Lou, et al. Plos One 2013 2004 Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低 2011 Cell Research: 采用的抗体(EpCAM)对EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程 3mL血→6个小时→得到