各种酶活力测定方法及注意事项.doc

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性 蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定 过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各 种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标 GB/T 23527-2009 附录 B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法 碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力 单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号 酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL） 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃ ± 0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐 标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ① 先将干酪素溶液放入 40 ℃ ± 0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ② 按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。 试管 A（空 试管 B（样 酶液 1.00 mL 酶液 1.00 mL 预热 2 min 预热 2 min 三氯乙酸 2.00 干酪素 1.00 mL mL 混匀 混匀 保温 10 min 干酪素 1.00 mL 三氯乙酸 2.00 mL 混匀 混匀 10000 r/min 10000 r/min 离心 2 min 离心 2 min 滤液 1.00 mL 滤液 1.00 mL 加碳酸钠溶液 5.00 加碳酸钠溶液 mL 5.00 mL 加福林试剂 1.00 mL 加福林试剂 1.00 mL 显色 20 min 显色 20 min 角蛋白酶活力的测定 1、角蛋白酶活力测定方法 试剂和溶液： a. 硼酸缓冲溶液（pH 10.5）：称取硼酸钠 9.54 g，氢氧化钠 1.6 g，加水至 900 mL， 搅拌均匀。用 1 mol/L 盐酸溶液或 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液调整 pH=10.5±0.05， 定容至 1000 mL。 b. 硼酸缓冲溶液（pH 9.5、11.5）：称取硼酸钠 9.54 g，加水至 800 mL，用氢氧化 钠溶液调整 pH=9.5±0.05 或 pH=11.5±0.05，定容至 1000 mL。 c. 10%三氯乙酸：10 g 三氯乙酸，加水至 100 mL。 d. 0.5%羊毛角蛋白溶液：取 0.5g 羊毛角蛋白加入 100ml 硼酸缓冲液溶解 测定方法： 取 1 mL 酶液（0.1 g 酶粉用对应 pH 缓冲液溶解离心，取上清液适当稀释）， 取 4 支具塞试管中，空白加 1mL 酶液、2 mL 0.5%羊毛角蛋白溶液（pH10.5、硼 酸缓冲液溶解）、2 mL 10 %三氯乙酸，对照加入 1ml 酶液和 2ml 角蛋白溶液，在 40℃恒温水浴锅中反应 1 h 后对照加 2 mL 10 %三氯乙酸终止反应，在 10000 r/min 离心 10 min，取上清液，过滤，在 280 nm 处测