载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题.pptxVIP

载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题;一、获取目的基因;四、筛选;一、获取目的基因;二、重组;载体;三、转化;常用的受体;重组和转化需要共同注意的问题;四、筛选;1.连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般连接粘性末端酶量的10-100倍。 　　?? 2.在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mgml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mgml。 　　? ?3.连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低效率。 　? ?4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。 　　? 5.在连接反应中，如不对载体进行去5‘磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。 　　? ?6.麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。 　　? ?7.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-alactosidase)水解后生成的吲哚衍显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的。 　　? ?8.在含有X-gal和IPTG的筛选上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。 ;五、表达;（三）融合表达;小组成员： 沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、周明毅 制作：曾宇