原代细胞培养实验2010-2011-2.pptVIP

原代细胞培养 实验 费晓芳 ? 掌握无菌操作技术。 ? 了解小鼠解剖操作技术。 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤。 ? 了解培养细胞的消化分散。 ? 了解细胞计数方法。 ? 了解倒置显微镜的使用。 实验目的和要求： 实验原理： ? 原代细胞培养 ? 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在 人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的 方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、 细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生 命现象。 实验内容： ? 动物的选择： 选择大约一半足孕时间的胚胎， 10 － 13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞， 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎 2-5 个 实验材料： ? 每组的超净台中有以下物品： ? 1. 50ml 配制好的 RPMI1640 培养液 1 瓶； 8ml 小牛 血清（ FCS) 1 瓶； 100ml 0.25% 胰蛋白酶 1 瓶； PBS(-)1 瓶 ? 2. 100ml 灭菌烧杯 2 个； ? 3 、 50ml 离心筒 2 个 ? 4 、灭菌培养皿 1 个，细胞培养瓶 1 个 ? 4 、 1ml ， 200μl 移液器各 1 支；枪头盒 2 个；无菌 玻璃搅拌棒 1 个 ? 5 、细胞计数板 1 块； ? 6 、灭好菌的镊子 1 把，剪刀 1 把； ? 7 、酒精灯 1 台； 试验操作步骤： ? 1) 胚胎的分离。适用哺乳动物 ( 仓鼠、小鼠和大鼠 ) ? a ．采用认可的方案处死啮齿动物。 ? b ．立即在无菌超净台内用 70 ％乙醇擦洗整个动物。 ? c ．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用 无菌镊子将皮肤扯向后腿。 ? d ．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的 子宫，置于无菌的培养皿上。 ? e ．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS 的 100ml 烧杯中。 ? f ．漂洗胚胎，去掉 PBS 。继续用 PBS 漂洗胚胎直至清洗 液清亮为止。 仔细清洗小鼠腹部 ? 2) 将 1 － 2 个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的 无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用 PBS 漂洗。 ? 3) 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 50ml 的无菌离 心筒中 , 加入 40ml 0.25 ％的无菌胰蛋白酶 , 用搅拌棒轻轻 搅动 。 ? 4) 在温暖的环境中或置于 37 ° C 培养箱中轻轻摇动 15 分 钟。 ? 5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮 细胞的液体转移至一无菌 50ml 的离心管中，该管内按照 每 10ml 上清加入 l ml 小牛血清的比例加入牛血清以灭活 , 胰蛋白酶。 ? 6) 加人新鲜胰蛋白酶溶液 ( 见前述步骤 ) 于含有残留未消化组 织块的原来的 50ml 离心筒中，重复步骤 4 和 5 。 ? 7) 离心混合的细胞悬液， 1200r ／ rain ， 5 分钟，弃上清。 ? 8) 用新鲜的无菌 PBS 重悬沉淀的细胞，按步骤 7 再次离心。 ? 9) 用 PBS 反复洗涤细胞直至上清清亮为止。 ? 10) 用含有 10 ％牛血清和抗生素 ( 如青霉素、链霉素 ) 的 DMEM(GIBCO ／ BRL)lOml 再悬沉淀，并使终体积为 20ml 。 ? 11) 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采 用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。 ? 12) 为确定现有细胞浓度，加入 0.2ml 细胞悬液于 1.8ml 1 ％ 醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。 （细胞记数方法见传代培养课件） ? 13) 按每细胞瓶 I x 10 6 细胞的数量接种于 10ml 组织培养液中， 在饱和湿度的 37 ℃ C0 2 培养箱中孵育直至细胞铺满。 ? 14 ） 24 小时后即可观察 。 细胞记数 ? 1. 按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞 重悬于细胞培养液中。 ? 2. 用沾有 70% 酒精的棉球擦净细胞计数板和 盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。 ? 3. 用移液器吸取细胞标本 10μl ，加入 10μl 台 盼氏兰溶液混匀，吸取 10μl 混合液从盖玻片 的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。 ? 4. 在显微镜下，计数或细胞。 ? 5. 计数细胞计数板每一小室中，上下左右角