《精选》圆二色谱CD原理.ppt

CD能够提供的信息： primary structure, secondary structure tertiary structure Alpha-helix,　beta-sheet 肽链骨架的构象变化 蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰： 190-250nm：肽键 280-290nm：酪氨酸tyr，色氨酸trp 10、 J-810圆二色光谱仪 S1-S2:第一级单色器；S2-S3:第二级单色器; M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L:透镜；F:滤光器； 由CDM交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质，透射光强度随时间的变化 当调制电压过其峰值（正和负）时， εR＞εL时，透过的右旋圆偏光的光强对应于最大值，而左旋最小（实线）； εR＜εL时，透过的左旋圆偏光的光强对应于最大值，而右旋最小（虚线）。 PMT的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所组成。 直流成分 IA=（IL+IR）/2 交流成分S相当于圆二色性 透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。 圆二色光谱仪工作原理 用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射样品测得透过样品后的强度IR和IL 由于IR和IL十分接近，令IA=（IL+IR）/2，S= IR – IL 只放大相应于S的PMT输出电压Es（交流信号），而不放大相应IA的输出电压EA。（适当选取放大倍数G值，使ESG与EA可比）。 Peltier Cell Holder CD/Total Fluorescence FMO Stopped Flow -20～200℃ The peptide bond is inherently asymmetric and is always optically active 蛋白质的光学活性 1、氨基酸的圆二色性 可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。 紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。 氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。 2、肽的圆二色谱 活性肽构象与其生理功能的关系 肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。 肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。 Far-UV (250-170nm) Secondary Structure: α-helix, β-sheet, β-turn, random Tertiary Structure Class: all-α, α+β, α/β, all-βI, all-βII Near-UV (320-250nm)： aromatic side chain Near-UV ~ Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins 苯丙氨酸（ phenylalanine， Phe）：255、261和268nm附近； 酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右； 色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和291nm附近； 二硫键的变化反映在整个近紫外区。 芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区表现出CD信号 Far UV CD spectra of poly-L-Lys 1、100% α-螺旋 2、100% β-折叠 3、100%无规卷曲 - band (nm) + band (nm) α-helix 222 208 192 β-sheet 216 195 β-turn 220-230 (weak) 180-190 (strong) 205 polypro II helix 190 210-230 weak Random coil 200 212 Main CD features of protein 2ndary structures 3、估算蛋白质二级结构含量 仅适合?含量较高的蛋白质！ 将测得的CD曲线与标准曲线拟合。 xa+ xb + xc = 1.0 qt = xaqa + xbqb + xcqc 改变xa、xb和xc，使qt与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，least squares minimization ） 未知结构的蛋白的CD信号 myoglobin qt = xaqa + xbqb + xcqc fits best with xa = 80% xb = 0% xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coil For further details: /cd/cdtutorial.htm GCN4-p1 0oC：100% helix 75oC：0%