（优质医学）高效液相色谱法简介.pptVIP

* 2. 色谱峰: 当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。 3.峰高与峰面积 峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peak height)。用h表示。 峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积(peak area)，用A表示。 * §2－1 保 留 值 一、保留时间（tR） 从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用tR表示。 * §2-2 色谱柱的分离效率及柱效能的评价 一、塔板理论 塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则 H=L/n 式中n为理论塔板数。 * 色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量地用理论塔板数N来表示。 理论塔板数一N还与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的V值。 * 可用半峰高处的峰宽(半峰宽）和保留时间的关系来表示理论塔板数N，这时关系式为： N＝5．54 ( tR / Wt1/2 ) 2 ﹙2﹚ 式中： Wt1/2 -------------半峰宽 例如，从图2-3，测得tR=105mm、 Wt1/2 =4mm，求得N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理论塔板数约为15200. * §2-3 分离度及影响因素 一 分离度（分辨率) 研究色谱中有关分离问题时，首先就是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。 从图8-3可以看出，为了获得较好的分离，就必须使最大峰值之间的距离增加，峰宽减小。 * * 一般用Rs来定量表达相邻两峰的分离程度，所以Rs是色谱中两个组分分离好坏程度的标志。要求RS1.5 tR1 －tR2 Rs = ———————— 1/2(W1+W2) 式中 tR1、tR2 分别为两组分的保留时间， W1 、W2为色谱峰的峰底宽度 . * §5 高效液相色谱的定性和定量分析 §5-1 定性分析 在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（t R′或V R ′ ）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。 * §5-2 定量分析 HPLC色谱定量的基本方法有内标法、外标法等。 外标法———标准曲线法 是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法则是相对定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。 * 具体作法是： 用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 * 目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离和分析与生物医学有关的大分子和离子型物质，易变质的天然产物，各种高分子化合物和不稳定化合物。 例如：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性剂、农药、甾族化合物、多环芳