生化实验04淀粉酶活性测定陈桃.pptxVIP

第1页/共15页0.8nm6个残基NRERE直链淀粉的螺旋结构直链淀粉NRERE?(1?6)分支点支链淀粉或糖原分支点的结构支链淀粉或糖原分子示意图1. 重要的多糖-淀粉1.4nm第2页/共15页开始分枝的残基两个葡萄糖单位之间的1，6-糖苷键非还原端残基两个葡萄糖单位之间的1，4-糖苷键支链淀粉的分枝结构第3页/共15页2、淀粉的酶促降解 a -淀粉酶 β-淀粉酶切α-1,4-糖苷键 淀粉的 水解 麦芽糖酶 酶促脱支酶 切α -1,6-糖苷键 降解异麦芽糖酶 磷酸解: 淀粉磷酸化酶第4页/共15页α－淀粉酶β－淀粉酶3. 淀粉的酶促水解淀粉酶 α－淀粉酶：在淀粉分子内部任意水解α-1，4糖苷键。产物为麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖（内切酶） β－淀粉酶:从非还原端开始，水解α－１，4糖苷键，依次水解下一个β－麦芽糖单位（外切酶）极限糊精第5页/共15页α-淀粉酶和β-淀粉酶的异同点：相同点：都作用于α-1,4糖苷键，产物都是麦芽糖不同点：　α-淀粉酶β-淀粉酶 可跨越分枝点 　　　 不能跨越分枝点 内切酶（随机切） 　　 端解酶（非还原端两两相切） 产物糊精分子量小 　　糊精分子量大（极限糊精） 耐70℃ 15min, 不耐酸 耐pH=3.3 酸性, 不耐高温 分布 发芽种子 休眠种子第6页/共15页实验04淀粉酶活性的测定（P174）第7页/共15页淀粉酶的作用机制及产物显色原理：α-淀粉酶（内切酶）麦芽糖等寡聚糖3，5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）淀粉β-淀粉酶（外切酶）麦芽糖D-麦芽糖一、目的二、原理第8页/共15页淀粉酶活性大小的表示方法：淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。以单位质量样品单位时间生成的还原糖的量表示。测定α-淀粉酶和β-淀粉酶：α-淀粉酶不耐酸， β-淀粉酶不耐热，本实验采用70。C保温15min钝化β-淀粉酶而测出α-淀粉酶。总活力减去α-淀粉酶活力则为β-淀粉酶活力。第9页/共15页三、材料、仪器设备及试剂材料：萌发的小麦种子（芽长1cm）仪器设备：分光光度计、恒温水浴、刻度试管、 容量瓶试剂： 1、标准麦芽糖溶液（1mg/mL） 2、3，5-二硝基水杨酸（含NaOH） 3、1%淀粉溶液第10页/共15页2、酶液制备 称取1g萌发的小麦种子 加少量蒸馏水 研磨 转入100 mL容量瓶 定容 放置15min 过滤 淀粉酶原液（酶液Ⅰ） 取酶液Ⅰ 10 mL于50 mL容量瓶，用蒸馏水定容 至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液（酶液Ⅱ）四、实验步骤1、麦芽糖标准曲线的制作 A540=0.264x-0.052 (x为mg麦芽糖）第11页/共15页3、酶活力的测定操作项目 管号 Ⅰ-1 Ⅰ-2 Ⅱ-1 Ⅱ-2淀粉酶原液（酶液Ⅰ）/mL 1.0 1.0 0 0钝化β-淀粉酶 置70 0C水浴中15min，取出后流水冷却淀粉酶稀释液（酶液Ⅱ）/mL 0 0 1.0 1.03，5-二硝基水杨酸/ mL 2.0 0 2.0 0预保温40 0C恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液/ mL（ 40。C ）1.0 1.0 1.0 1.0保温40 0C恒温水浴中保温5min 3，5-二硝基水杨酸/ mL 0 2.0 0 2.0取4支干净的具塞刻度试管，编号，按下表操作：摇匀，沸水浴中5min，取出流水冷却，加蒸馏水至20mL。摇匀，540nm比色测定。第12页/共15页空白管：2 mL蒸馏水 + 2 mL3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，定容至20 mL第13页/共15页五、实验数据VT= VS= W=AⅠ-1= AⅠ-2 = △A1 = AⅠ-2 - AⅠ-1 x1=AⅡ-1= AⅡ-2 = △A2 = AⅡ-2 - AⅡ-1 x2=第14页/共15页 X1 × VT α-淀粉酶活力[mg/(g.min)]= W ×VS ×t X2 × VT × N(α+β)-淀粉酶活力[mg/(g.min)]= W ×VS