过表达慢病毒载体构建和包装使用指南version1.docVIP

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月 1/ 33 目 录 简 介 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 第一部分 过表达慢病毒载体的制备 实 验 流 程 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 4 实 验 材 料 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 5 过 表 达 克 隆 制 备 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 6 第二部分 慢病毒包装与滴度检测 实 验 流 程 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 7 实 验 材 料 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 8 L e n t i v i r u s 病 毒 包 装 … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 1 病 毒 的 收 获 及 浓 缩 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 2 L e n t i v i r u s 滴 度 测 定 … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 4 参 考 文 献 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 3 2/ 33 简 介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基 因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达 且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感 染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除 并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危 险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公 认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由 GV 慢病毒载体系列、pHelper 1.0 载体和 pHelper 2.0 载体三质粒组成。GV 慢载体中含有 HIV 的基本元件 5’LTR 和 3’LTR 以及其他辅 助元件，例如 WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对 GV 载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0 载体中含有 HIV 病毒的 gag 基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol 基因，编码病 毒特异性的酶；rev 基因，编码调节 gag 和 pol 基因表达的调节因子。pHelper 2.0 载体中含有单纯疱疹病毒来源的 VSV-G 基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对 GV 慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有 特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因 RNAi 慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为 了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够 针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。 3/ 33 第一部分 过表达慢病毒载体的制备 一、 流程图 从含有目的基因的质粒中，利用 PCR 方法钓取目的基因，将目的载体进行酶切，酶切产物电 泳回收后进行交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落 PCR 鉴定，再对 PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。 4/ 33 二、 实验材料描述 a) 主要试剂 试剂名称 试剂来源 cat.No. 1kp DNA ladder Marker Fermentas 公司 #SM0311 250bp DNA ladder Marker 捷瑞公司 DL250+,100T 琼脂糖 赛百盛公司 GA4-100 限制性内切酶 NEB 公司 R0136V In-Fusion? PCR Cloning Kit clontech 639626 Taq polymerase SinoBio E001-02B dNTP Takara D4030A Primer 捷瑞生物 Plasmid 抽提 Kit Promega A1460 b) 主要仪器 仪器名称 仪器来源 cat. No. PCR 仪 Applied Biosystems 公司 2720 the