实验四五章 大肠杆菌感受态的制备质粒DNA的转化及转化子筛选概述.pptVIP

实验四、五 大肠杆菌感受态的制备、质粒 DNA 的转 化及转化子筛选 授课教师：张运峰 授课班级： 12 技术 一、实验目的 ? 掌握利用 CaCl 2 法制备 大肠杆菌感受态的原理； ? 掌握质粒 DNA 转化、转化子筛选的原理； ? 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。 一、实验原理 常用预冷的 CaCl 2 处理细菌制备感受态细胞：用低温（0℃） 低渗 CaCl 2 溶液处理快速生长的细菌，即可获得感受态细菌。 此时细菌膨胀成球形，外源 DNA 分子在此条件下易形成抗 DNA 酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促 进细胞对 DNA 的吸收。 在一定条件下，外源ＤＮＡ片段与感受态细胞混合、保 温和热激，进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子 通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新 的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养， 即可筛选出转化子，即带有异源ＤＮＡ分子的受体细胞。 二、实验所需器材和试剂 （一）仪器设备： 恒温摇床 , 电热恒温培养箱 , 台式高速离心机 , 无菌工作台 , 低温冰箱 , 恒温水浴锅 , 制冰机 , 分光光度计 , 微量移液枪。 （二）试剂： 1.LB 固体和液体培养基。 2. 100mM CaCl 2 溶液。 3. 待转化质粒。 三、实验步骤 1. 挑取一DH5α单菌落于 20ml LB 培养液中37℃过 夜培养 。 2. 取其中 800ul 菌液于一含 20mlLB 培养液的锥形瓶， 37℃振摇培养至 OD 600 值达到 0.4-0.6 之间 . 3. 取 1.5ml 菌液置于离心管内， 4 ℃ 10000g 离心 1min ，去掉上清。 4 ℃ 10000g 离心 1min 4. 加入 1ml ,100mM 的冰冷 CaCl 2 溶液， 反复吸打 混匀 ，使细胞重悬，然后冰浴 30min. 1ml 、 100mM 的冰冷 CaCl 2 5.4℃ 10000g离心 5 分钟收集细胞，然后瞬时离 心并去掉残液；最后，加 100uL 、 100mM 的冰冷 CaCl 2 溶液，轻轻反复吸打悬浮细胞 , 冰上放置 3-5min, 即 成感受态细胞悬液。 6. 感受态细胞暂且不用时加入等 V30% 的甘油，贮 存于 - 70℃可保存半年，取其中一份进行转化。 加入等 V30% 甘油 7. 向转化管中加入 1uL 质粒 DNA( 不超过 10uL), 旋转 3-5 圈混合 ，最后于冰上放置 30min 。 8. 将上述混合物转移到42℃的水浴锅中，热 休克 90s( 不要摇动试管 ) ，然后将试管迅 速转移到冰浴，冷却 1-2min 。 9. 向管内加入 800ul 的 LB 培养液。然后37℃ 培养 45min-1h 。 10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素 的 LB 固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。 室温放置 15 分钟 .