葡萄球菌肠毒素c纯化探究总结.pptxVIP

葡萄球菌肠毒素C的纯化研究;一、培养基及培养条件的优选 二、用分子截留方法浓缩肠毒素原液 三、用DEAE-纤维素（系Pharmacia 产品）柱层析作第一步提取 四、用Sephadex G-75分子筛层析柱进一 步纯化 五、纯化前后SET-C的SDS鉴定 六、纯化后的SET-C分子量测定 七、对SET-C纯化品的N末端氨基酸测定;前言;一、培养基及培养条件的优选 ;结果证明：胰酪胨综合培养以摇瓶培养金黄色葡萄球菌，其产生SET-C最高。因此，我们在作SET-C提纯时就决定采用胰酪胨综合培养基及摇瓶培养方式来制备肠毒素原液。 ;二、用分子截留方法浓缩肠毒素原液;三、用DEAE-纤维素（系Pharmacia 产品）柱层析作第一步提取;即将上一步浓缩透析过的SET-C原液缓慢加入使全部入柱后。先用PH5.0 0.01mol/L PB洗涤，使有色液体流尽。其后作分管收集，每10分钟收集一管，其量为7.5ml，对收集液逐管在OD280nm紫外分光自动检测仪测蛋白峰出现管数。 ;其后相继换用PH 6.6、0.06mol/L PB和PH 6.8，0.2mol/L PB分步洗脱，洗速为45ml/hr，每管仍用OD280nm紫外分光自动检测仪测洗脱液蛋白吸收峰。并对各峰洗脱液合并，再用反相胶乳凝集试验（RPLA）检测是否有SET-C存在，合并蛋白峰。收集结果证明SET-C 在第Ⅱ峰，结果见图1，并对Ⅱ峰用PEG浓缩至一定量，提供下一步纯化。 ;图1：用DEAE-纤维素层析结果 ;四、用Sephadex G-75分子筛 层析柱进一步纯化;上样后用0.01mol/L PH7.4 PB洗脱，洗脱液出现一个蛋白峰，用RPLA检测毒素即在此峰，收集Ⅰ峰混合，浓缩。结果见图2： ;对截留后浓缩液及通过DEAE纤维素柱层析与Sephadex G-75分子筛过柱后各项内容的变化情况见表1：表1：SET-C的提纯及回收率;五、纯化前后SET-C的SDS鉴定 ;CBA ;六、纯化后的SET-C分子量测定;（M: standard protein S: sample） 图4 SDS测定肠毒素C分子量;从图4、图5中可见纯化SET-C在PAGE中呈现单一条带，通过与标准蛋白分子量比较计算，SET-C的分子量约在28000dalton左右。;七、对SET-C纯化品的N末端氨基酸测定;谢 谢