乳鼠肾细胞的原代培养盛心磊.docx

细胞生物学实验盛心磊 2009012337 乳鼠肾细胞的原代培养 生92 盛心磊 2009012337 同组成员：王璇 实验时间：2012年4月19至4月26 实验目的： 学习、了解细胞原代培养的一般方法与步骤。 掌握无菌操作技术。 复习并再次练习细胞的传代培养技术。 实验器材与试剂： 1.实验器材： 超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器、酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培养瓶、离心管等 。 2.实验试剂： PBS溶液：以成品干粉加超纯水配制；过滤后121oC 灭菌20 min，4oC 保存 消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液 DMEM培养基（含10%胎牛血清及双抗） 3.材料： 三天左右的乳鼠（每人解剖一只）。 实验步骤： 消化法：（以下写的是我实际操作时的步骤） 将乳鼠（3天左右）断头放血致死。 进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。 在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。 用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有 PBS溶液的平皿中。 将肾脏剪成数块，用PBS溶液再洗涤一次。 吸去PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀）。 加入0.5mL 胰酶—EDTA溶液，于37℃消化20～30分钟，直至组织块变白、呈疏松状。 加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，反复“吹打”分散细胞。 去除大块组织后，1 000rpm离心10min；弃上清 。 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入到10mL培养瓶中（每瓶1.5 mL，每瓶80 ～100万细胞）， 37℃、5% CO2培养。 取少量细胞悬液（20uL） ，以PBS溶液稀释10倍后进行计数。 1 ～ 2日后，更换部分或全部培养液。 细胞生长成单层后，即可进行传代培养。 整理： 取肾后，将鼠尸体置于专门的垃圾袋中。 蜡盘、大头针用洗干净后，浸泡于酒精中。 小剪刀、小镊子在超净台中，可放置在专用的器械缸中；用毕洗刷干净，按规定放置（216，盆中）。 实验结束将废物缸中的物品及平皿丢弃，将废物缸洗净、控干水分，以酒精擦拭后置于超净台中。 需要回收的培养皿洗净后放在规定处。 肾细胞的传代培养： 吸弃原培养基，以PBS溶液洗细胞1-2次； 加入200uL消化液，37 ℃消化3-5min（具体时间根据观察结果决定）； 加500uL含10％血清的DMEM培养基终止消化； 1 000rpm，离心10min（实验中我未进行离心）； 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞； 按比例分盘，取250uL和450uL分别接在两个新的培养皿中，放在37oC、5％CO2培养箱中培养； 观察记录细胞生长状况并拍照。 实验结果： 乳鼠肾细胞的原代培养照片： 乳鼠组织贴壁细胞 乳鼠组织 贴壁细胞 图1 乳鼠肾细胞的原代培养（放大倍数10×40倍） 上图表示的是乳鼠肾细胞的原代培养的情况。图中标示出的是贴壁细胞，呈梭形，数量较多。图中较亮的部分不是贴壁细胞，有可能是乳鼠肾脏内的一些结缔组织或脂肪组织。通过观察，我发现培养皿中部分区域都有细胞贴壁的现象，大约占到底面积的50%，因此决定先不传代。在更换培养基后，我将其放在培养箱中继续培养，一天后传代。 贴壁细胞图2 乳鼠肾细胞的原代培养（放大倍数10×40倍） 贴壁细胞 如上图，培养皿的大部分区域都已经被贴壁细胞覆盖，覆盖面积大约达到了70%，因此决定进行传代培养。 乳鼠肾细胞的传代培养照片 图3 乳鼠肾细胞的传代培养照片（放大倍数10×40倍） 如图所示，左边的图表示的是传代时体积较少的细胞在传代一天后的生长情况。可以看到，细胞数量较多，大部分都已经贴壁，生长良好。总体上而言，较少的这一盘细胞长势很好，底面积的覆盖率大约达到了40%。右图表示的是分盘时细胞较多的一盘。经过一天的培养，底面积的覆盖率达到了70%。 图4 乳鼠肾细胞的传代培养照片（放大倍数10×40倍） 图4表示的是传代2天后细胞较多的一盘细胞的生长情况。该盘细胞密度较大，覆盖率达到了100，而且培养基的颜色发生了变化，由原来的紫色变成了淡红色，说明细胞活性强，生长较快。 图5 乳鼠肾细胞的传代培养照片（放大倍数10×40倍） 图5表示的是传代3天后细胞较少的一盘的细胞的生长状况。如图所示，细胞的生长情况良好，覆盖率也接近100%。 两盘细胞的覆盖率都已经达到较高，停止实验。 分析与讨论： 原代细胞培养每天观察的主要内容： 每天需要观察的项目有：培养皿中是否有污染，细胞生长状态，PH（通过培养液颜色变化）。 如