乳鼠肾细胞的原代培养.docx

乳鼠肾细胞的原代培养生 乳鼠肾细胞的原代培养 生72伍国羽2007012357 PAGE 5 乳鼠肾细胞的原代培养 生72伍国羽2007012357 实验日期：2009年11月27日 星期五 实验目的 掌握原代细胞培养的原理与操作方法，了解无菌操作的条件和注意事项； 了解并通过实践学习处死与解剖乳鼠和识别、取出乳鼠肾脏的方法； 学习细胞原代培养和传代培养的方法。 实验原理 新生约3天的乳鼠体内的组织与器官均没有发育成熟，处于旺盛的分裂生长时期，因此是用作细胞培养的良好材料，适当的培养就可以观察到贴壁和分裂增殖现象。由于肾脏的细胞类型较为单一并且肾脏本身易于从乳鼠体内取出，将肾作为实验材料是较好的选择。在进行细胞培养之前，首先要从组织中提取出大量的分散的单细胞并制备成细胞悬液。这就需要首先破坏细胞外基质以及细胞连接对组织细胞的“束缚”。胚胎或新生动物的组织中细胞外基质和细胞连接并没有充分形成，这也是将新生动物作为实验材料的原因之一。 原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。 最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。本实验中使用的是分散细胞培养。 实验用品 实验材料：超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器、酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培养瓶、离心管等 实验试剂：PBS溶液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液、DMEM培养基 实验步骤 将乳鼠（3天左右）断头放血致死。 进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。 在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。 用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有 PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪。 纵向将肾脏剪开，除去肾盂。将肾脏剪成数块，用PBS溶液再洗涤一次。 吸去PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀）。 加入0.5mL 胰酶—EDTA溶液，于37℃消化20～30分钟，直至组织块变白、呈疏松状 加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，反复“吹打”分散细胞 去除大块组织后，1 000rpm离心10min；弃上清 加入PBS溶液重复洗涤、离心一次 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；取少量细胞悬液（100uL） ，以PBS溶液稀释后进行计数 将细胞悬液按比例稀释后，分装至10mL培养瓶中（每瓶1.5 ～ 2mL，每毫升40 ～ 50万细胞）， 37℃、5% CO2培养 1～2日后，更换部分或全部培养液 细胞生长成单层后，即可进行传代培养 吸弃原培养基，以PBS溶液洗细胞1-2次； 加入200uL消化液，37 ℃消化3-5min； 加500uL含10％血清的DMEM培养基终止消化； 1 000rpm，离心10min； 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞； 按比例分盘， 37oC、5％CO2培养； 观察记录细胞生长状况。 实验结果与讨论 原代细胞培养细胞48小时后观察细胞，覆盖度达到了40%~50%，细胞贴壁情况良好。换液后仍有少量死细胞漂浮。 图1.原代细胞培养48小时图。细胞覆盖度达到了40%~50%，贴壁情况良好。有少许死细胞漂浮。 原代细胞培养至第4天，细胞贴壁和长势都很好，细胞覆盖度达到了90%，可见少量死细胞漂浮。拍照后进行细胞传代培养。 图2. 原代细胞培养96小时图。细胞贴壁和长势都很好，细胞呈梭形，覆盖度达到90%。可见少量死细胞漂浮。 细胞进行传代后会经历以下时期： (1)游离期： 接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。 (2)吸附期： 细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞、传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。一般多数细胞都可在24h内贴壁，平均贴壁时间大约5-20min。而细胞状态不好及濒死细胞、培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。 (3)繁殖期：圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞，此时虽有细胞