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ICS 65.020.20 B 16 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T XXXXX—XXXX 苹果轮纹病菌快速检测方法 Rapid detection of botryosphaeria dothidea XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/ XXXXX—XXXX 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。 本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。 I DB37/ XXXXX—XXXX 苹果轮纹病菌快速检测方法 1 范围 本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。 本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10-7ng/ μL苹果轮 纹病菌DNA。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 原理 3.1 扩增原理 根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对，特异性序列参 见附录A。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基 因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物， 加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。 3.2 显色液显色原理 SYBR Green I是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链 DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不 发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大 幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 LAMP：环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal amplification） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid） ITS：内转录间隔区 （Internal transcribed spacer） 2×Lamp Master Mix：等温扩增PCR混合液 Bst酶：Bst DNA 聚合酶 （Bst DNA polymerase） 5 试剂和材料 1 DB37/ XXXXX—XXXX 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T 6682中规定的