《分子生物学》第6次课基因工程的研究策略与实践.pptx

基因工程的研究策略与实践什么是基因工程？n 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载 体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参 入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能 持续稳定地繁殖。n genetic engineering、 gene engineering 、 gene manipulation 、recombinant DNA technique、genecloning 、molecular cloning基因工程的主要内容或步骤n 从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步 骤，分离出带有目的基因的DNA片段。（切）n 在体外，将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能自我复制 的并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。（连）n 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之 一起繁殖。（转、筛）n 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体 细胞克隆。（扩）n 从这些筛选出的受体细胞克隆，提取出已经得到扩散的目的基 因，供进一步分析研究使用。n 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产出人类所需要的物质。3n 一般原理基因表达 蛋白质纯化n 原理应用以一个研究生的课题为例4第一部分基因表达DNA分子中所蕴藏 的遗传信息通过转录 和翻译形成具有生物 活性的蛋白质或通过 转录形成RNA发挥功能 作用的过程。原核转录本－基 因的全长拷贝tRNArRNAhnRNA ——mRNA真核断裂基因的转录本－其表达子的相应拷贝5n 转录 (transcription)n 转译 (translation)转录转录后的加工： 剪接、加帽、 加尾翻译肽链的起始、 延长、终止翻译后加工人骨形成蛋白 重组酶（先天性酶缺陷） 融合蛋白（抑制为作用机理） 外源重组蛋白（水蛭素）多肽类激素药（人胰岛素、人生长激素、卵泡刺激激素） 人造血因子（促红细胞生成素、GM-CSF） 人细胞因子（α干扰素、β干扰素、IL-1、IL2、IL11） 人血浆蛋白因子（凝血因子VIII、VII）8重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）说明书（大连）【药品名称】 通用名称：重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）英文名称：Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant DNA Techniques in Hansenula Polymorpha Yeast汉语拼音：Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Hanxun Jiaomu)【成分和性状】 本品系由重组汉逊酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化， 加铝佐剂吸附后制成。为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散。 主要成分为乙型肝炎表面抗原；辅料包括氢氧化铝、氯化钠、硫柳汞。【接种对象】 本疫苗适用于乙型肝炎易感者，尤其下列人员：（1）新生儿，特别是母亲为HBsAg、HBeAg阳性者。（2）从事医疗工作的医护人员及接触血液的实验人员。（3）有乙肝病人或乙肝携带者的家庭成员。【作用和用途】 接种本疫苗后，可刺激机体产生抗乙型肝炎病毒的免疫力，用于预防乙型肝炎。9外源基因在原核细胞中的表达外源基因片段的分离表达载体的构建表达性重组体的构建 转化宿主菌诱导表达表达产物的鉴定 表达产物的分离外源基因在真核细胞中的表达外源基因片段的分离表达载体的构建表达性重组体的构建 转化宿主细胞稳定转化克隆的筛选 表达产物的鉴定表达产物的分离基因表达载体Prokaryotic expression vector原核表达载体Baculovirus expression vector昆虫杆状病毒表达载体Mammalian expression vector哺乳动物表达载体Yeast expression vector酵母表达载体Adenoviral and retroviral vector腺病毒及逆转录病毒表达载体T7 promoterRBS 核糖体结合序列Start codonMCSTranscription terminatorAmprT7expressionvectorori启动子——是DNA链上能被RNA聚合酶识别的特定的一段DNA序列，控制转录的起始。n PL噬菌体左向启动子n Lac乳糖操纵子的启动子n trp启动子 n tac启动子 n T7启动子T7 promoterRBS 核糖体结合序列Start codonMCSTranscription terminatorAmprT7expressionvector融合表达 分泌表达ori启动子正性调节的 激活蛋白操纵子——在细菌中，许多基因按照功能的相关性成群串联在一起，组成转录单 位，受同一启动子驱动转录成多顺反子。这种由若干结构基因及共同的启动子以及行使控制