《分子生物学》第14次课组学与医学.ppt

蛋白质的胶内酶切 包括：感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程 （二）质谱技术是蛋白质组鉴定的重要工具 1．用肽质量指纹图谱鉴定蛋白质 2．用串联质谱鉴定蛋白质 蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱（PMF），通过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质。 用PMF方法不能鉴定的蛋白质可通过质谱技术获得该蛋白质一段或数段多肽的串联质谱（MS/MS）信息并通过数据库检索来鉴定该蛋白质。 蛋白质的质谱分析 （三）蛋白质相互作用研究是认识蛋白质功能的重要内容 蛋白质-蛋白质相互作用是维持细胞生命活动的基本方式。 研究蛋白质相互作用常用的方法有酵母双杂交、亲和层析、免疫共沉淀、蛋白质交联、荧光共振能量转移（FRET）等。 蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选 常用蛋白质相互作用的研究技术 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理，分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 1.标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 2.酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 3.免疫共沉淀 免疫共沉淀耦联质谱技术特点 生理条件下蛋白质之间的相互作用 所有蛋白质与靶蛋白的相互作用 可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 缺点 灵敏性不高 假阳性 受免疫球蛋白的干扰较大 研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白 抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀 SDS分离免疫沉淀复合物 切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签 搜索数据库 4.蛋白质芯片（protein chips，protein array） 基本原理 将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析 依据的杂交反应原理 抗原-抗体反应 配体-受体反应 蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质组学的医学应用 （一）寻找疾病相关蛋白质 （二）发现和鉴别药物新靶点 （三）不同生物蛋白质组的比较性研究，可对生物进化提供参考 1.转录组及蛋白组的概念分别是什么？其研究内容分别包括哪些方面？ 2.如理利用转录组学及蛋白组学的方法筛选疾病相关基因？（写出主要的检测指标及其实验方法的名称） * ①获得能代表某 一转录体特异性信息的标签(tag)约为9～14bp; ②连接标签组成的DNA片段,即形成串联体(Concatemer), 进行扩增后测序分析,得到代表转录体信息的标签序列; ③ 同一标签的重复次数代表该转录体的表达水平。 常规 SAGE方法的操作流程 SAGE在生命科学中的应用 SAGE是一项快捷、有效的基因表达研究技术 1、动物基因组转录图谱的构建 可以利用SAGE技术得到的特定的数据信息，将基因定位在染色体上，根据基因对应的标签丰度，以染色体长度为横轴，转录水平（标签丰度）为纵轴，绘制转录图谱，这样可以识别单纯序列信息所不能预测的基因。 2、动物基因功能的研究 应用SAGE研究未知基因的功能是其最主要的用途之一 根据与未知基因表达图谱一致或相似的已知基因，可以推测该新基因的功能 Knoll等用 SAG E 技术和蛋白质组学同时分析斑马鱼发育完全的卵泡中的基因表达，并与其它动物卵细胞的基因表达进行比较分析，发现在27486个SAG E 标签中有11339 个表达水平不同，而且鼠李糖结合凝集素 、β-肌动蛋白2和1个转录位点与H2B 组蛋白家族类似的3个基因在哺乳动物卵或未受精 蛋中均高度表达，推测这3个基因可能参与了动物精子和胚胎的早期形成。 3、动物发病机制的研究 疾病的发生多是由于正常的生理状态下基因表达发生改变的结果 通过比较分析发病组织细胞和正常组织细胞中基因表达的变化和差异，可以了解疾病发生、发展的过程，明确疾病发生的机制 （三）MPSS 大规模平行信号测序系统 （massively parallel signature sequencing ,MPSS） MPSS是以基因测序为基础的新技术