病毒鉴定的方法 科四第5组.ppt

病毒鉴定的方法 12 科四第五组：黄昭媛 万 敏 李晓塽 陈泽群 ? 病毒的检测手段和方法在不断发展和 改进，但无论是什么样的方法，病毒 所共有的 两个特性 而发展起来的： ? 一是病毒的 侵染性 。 ? 二是病毒作为 核蛋白 的特性，也就 是病毒理化性质。 病毒鉴定的方法： 1 、电子显微镜检测法 2 、电镜复染检测法 3 、免疫电镜检测法 4 、血清学检测法 5 、酶标免疫吸附法 6 、基因检测技术 7 、蛋白指纹图谱 1 、电子显微镜检测法 电子显微镜技术是最直接，最准确的检 测病毒的手段，它可以直接看到病毒的形 态结构、存在与否，所以在进入了分子水 平的今天它仍然有着不可替代的作用。 原理： 电子显微镜以电磁波为光源 , 将感 病植物组织制成检测样本 , 利用短波电子 流 , 在电子显微镜下观察 , 可根据病毒的 形态、大小、内含体以及染病组织超微结 构等诊断病毒的种类。 返回 2 、电镜负染检测法 电镜负染技术是 20 世纪 60 年代开始使 用于英国试验室，其图像如同一张照相的 底片，因此人们习惯地称为负染色，电镜 负染技术也就由此而生。 原理： 一些重金属离子能绕核蛋白体四周沉 淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白 体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区， 由此辨别病毒。 返回 3 、免疫电镜检测法 免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技 术相结合的产物，在电镜制样过程中，于铜网上 先铺展一层细胞色素 A ，稍后再添加一滴抗体， 多余液滴用滤纸吸掉，最后点上一滴抗原和染液， 由于细胞色素 A 的作用，减少了样品即抗体、抗 原的表面能力，能形成均匀的涂层。 原理： 在电镜制样过程中，病毒颗粒不能集中的 沉积在有效的电镜视野内，而容易造成电镜观察 时的疏漏，免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和 性与吸附性的这一特点，使病毒能较集中地沉集 在有效视野内，从而便于电镜下的观察，提高了 检测几率 。 返回 4 、血清学检测法 动物受其致病细菌、病毒侵染后，动物体内 血液中的球蛋白发生变化而产生抗体，引起动物 产生抗体的物质简称为抗血清。由于不同病毒产 生的抗血清都有各自的特性 , 因此可以用已知病 毒的抗血清来鉴定病毒种类。 原理： 病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白是一 种很好的抗原 , 血清中的抗体能与同系的抗原在 体外特异的结合，使抗原失去活力。 返回 5 、酶标免疫吸附法 该方法最早用于动物病毒的检测，近二三十年才应 用于植物病毒的检测，并作为病毒的定量方法广泛应用 于病理、免疫学的研究和生产实践中，对病毒进行快速 检测。此法的最大优点是灵敏度高，很多的病毒因其浓 度太低或某种抑制剂的干扰，常规血清学方法检测不出 时，此法就显示出独特的优越性。 原理： 将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试 的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定， 再加入酶标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后 会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方 法可测定出病毒的浓度。 返回 6 、基因检测技术 基因检测技术对病毒的检测已经达到分子水 平，其灵敏度和特异性是任何生化方法的检测所 不能比拟的，同时可以省略大量的病毒提纯和血 清的制备工作。 原理 : （ 1 ）分子探针杂交检测技术，利用一定序 列的核苷酸合成探针，通过分子杂交技术，检测 出供试样品中与之相补的碱基序列。 （ 2 ） PCR 技术 是通过体外扩增可以使供试 样品中的目的基因片段很快扩增，使之达到了对 即使是病毒含量极低的样品，也能灵敏准确地得 到定性的结果。 返回 PCR 技术： 原理： PCR 技术是一种在体外将特异性 DNA 序列进行高效扩增的方法。 PCR 扩增 DNA 片 断的特异性是由两个人工合成的寡核昔酸 引物的顺序决定的 , 引物位于靶 DNA 的两侧 , 并分别和相对 DNA 链互补。 步骤 : ①将待扩增标本 ( 靶 DNA) 在高温下变 性 , 双链解离 ; ②降低温度 , 使两引物结合