临床PCR检验标本的采集处理存及核酸提取方法.ppt

去除或减轻抑制的一些方法 ? 加入 0.6% (wt/vol) 牛血清白蛋白（ BSA ）可 降低血液对 Taq DNA 聚合酶的抑制效应， 既使在 2% （ vol/vol ）血液存在下亦可成功 扩增，而通常血液含量只能是 0.2% 。 ? BSA 也可增加 Taq DNA 聚合酶的扩增能力， 使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能 力分别提高 10 和 20 倍。 ? 单链 DNA 结合 T4 基因 32 蛋白（ gp32 ）有类 似 BSA 的增强效应。 核酸纯化 ? 核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年 代，在七十年代和八十年代中传统的核酸 沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用 和推广。 ? 传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、 蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等 步骤。 一般核酸提取试剂促使靶核酸 从细胞内释出的原理 ? 靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞 浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病 原微生物 , 则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫 或真菌细胞内，如果上述细胞破裂 , 则靶核酸 亦可存在于细胞外。 ? 一般均使用去垢剂 ( 如 Triton-100) 裂解细胞， 用一种蛋白裂解酶 ( 如蛋白酶 K) 消化结合于核 酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出 来。 核酸的分离纯化 ? 核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类 等干扰核酸扩增的物质去除。 ? 经典方法 ? 硅吸附法 ? 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验 室在使用前，必须对其核酸提取纯度 和效率进行评价。 DNA 提取的经典方法 ? 即所谓的” 酚 - 氯仿提 取法” RNA 提取的独特性 ? 临床标本及实验室环境中 , 存在大量对 RNA 具有强烈降解作用的 RNase ，而 RNase 较耐高温 , 不易失活。 ? 如何避免 RNase 对标本的污染及防止 RNase 对 提 取 的 RNA 的 降 解 , 是 保 证 RNA 成功提取的关键之所在。 RNA 提取所用器皿的处理 ? 经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管 , 离心管等基 本上无 RNase, 可以不经预处理直接用于制备和贮存 RNA. ? 实验室用的普通玻璃器皿经常有 RNase 污染 , 使用前必须于 180 ℃ 干烤 8 小时以上 , 或用 0.1% 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 的水 溶液浸泡用于制备 RNA 的烧杯 , 试管和其它用品。 ? DEPC 是 RNase 的强烈抑制剂。灌满 DEPC 的器皿于 37 ℃ 下 放置 2 小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于 100 ℃ 干烤 15 分 钟，最后高压蒸汽下 15 分钟。上述处理可除去器皿上痕量 的 DEPC, 以防 DEPC 通过羧甲基化作用对 RNA 的嘌呤碱基 进行修饰。 RNA 提取所用溶液的准备 ? 对于 RNA 提取所需溶液的配制 , 必须用高压灭菌的 水和 RNA 研究专用的化学试剂配制溶液 , 用干烤过 的药匙称取试剂 , 将溶液装入无 RNase 的玻璃器皿。 可能的话 , 溶液均应用 0.1TPC 于 37 ℃ 至少处理 12 小时 , 然后于 100 ℃ 加热 15 分钟或高压蒸汽灭菌 15 分钟。 ? 须注意的是 ,DEPC 可与胺类迅速发生化学反应 , 因 此不能用来处理含有 Tris 一类的缓冲液 , 因此可存 几瓶新的 , 未开封的 Tris 试剂以制备无 RNase 的溶液。 RNA 提取中 RNase 污染的控制 ? 实验操作人员的手是 RNase 污染最主要的潜 在来源。 ? 策略是： 在准备用于 RNA 纯化的实验材料和溶液时 , 以及在涉及 RNA 的整个提取操作过程中 , 都 应戴一次性手套。 在 RNA 提取实验中，应勤换手套。 RNA 提取的常用方法 ? 表面活性剂加蛋白酶 K ，氯仿 - 酚抽提法。 ? 胍盐提取结合氯仿 - 酚抽提法。 ? 胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬 浮吸附法等。 异硫氰酸胍结合氯仿 - 酚提取法 核酸提取的改良方法 ? 旋转离心柱（ SPIN COLUMN ）方法 ? 玻璃粉吸附法 ? 二氧化硅（ Se ）或硅藻吸附法 ? 微量全血核酸提取法 ： NaI 方法 ? 其它方法：疏水性 Immobilon-P 膜 、全 自动核酸纯化仪 旋转离心柱（ SPIN COLUMN ） ? 属于硅吸附方法的一种。在原理上现行的旋转离 心柱系统通常可分为三个部分： （ 1 ）利用裂解液促使细胞