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细胞生物学实验报告 细胞冻存 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理 在低于 -70℃的超低温条件下，由机体内部的生化反应极其缓慢，甚至终止，因此采用 适当的方法将生物材料降至超低温条件， 即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。 当 以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。 冷冻保存就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保存液的溶液中， 以一定的冷冻速率 降至零下某一温度， 并在此温度下对其进行长期保存的过程。 水在低于零度的条件下→结 冰→细胞死亡。 如向培养液加入保护剂， 可使冰点降低。 在缓慢的冻结条件下，能使细胞内 水份在冻结前透出细胞。贮存在－ 130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（ DMSO ）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解 度大， 易穿透细胞。 最适冷冻速度： 不同细胞的最适冷冻速度不同。标准冷冻的开始速度为 1 至－ 2℃ /min ，当温度低于－ 25℃时，可加速， 到－ 80℃时可直接加入液氮中 （－ 196℃）。 复苏细胞时则直接将细胞的冻存管放到40℃热水中迅速解冻。 二、实验目的 1、掌握无菌操作技术。 2、 .掌握细胞冻存的一般方法与步骤。 3、掌握培养细胞的消化方法。 4、了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 三、实验仪器、材料、试剂及用品 1、仪器：超净工作台、 CO2 培养箱、倒置相差显微镜 2、材料：人宫颈癌 HeLa 细胞 3、试剂：胰酶、 DMEM 培养基、血清、 DMSO 、抗生素 4、用品：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸， 75％酒精棉球，酒精灯 四、实验步骤 1、穿好实验服，进入无菌室前穿鞋套、洗手。 2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用 液置 370C 下预热。 3、无菌室及超净台紫外线照射，关闭超净台紫外灯 , 打开可见光灯开关，打开抽风机，用 75%酒精擦双手消毒，再用酒精棉擦拭桌面。 4、点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧 后插在无菌试管内。 5、配置 5ml 冻存液 （ DMEM 70% ，FCS 20%，DMSO10% ），即 DMEM 3.85ml ，FCS 0.65ml ， DMSO0.5ml 。 6、取待冻存的细胞用胰酶消化，靠近火焰倒胰酶，显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞 大部分收缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻转培养瓶停止消化。 7、加两滴管 2mL 冻存液，即全面吹打细胞瓶壁 ,吹打均匀，细胞浓度宜大， 3×106 个 /mL 左右。 8、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记（写上细胞种类，时间及冻存条件等） 。 冻存管在 40℃下存放 30 分钟，转放 -20℃ 1.5～ 2 小时 , 再转入 -700℃，4～ 12 小时后即可转移到液氮内，注意进行登记。 五、实验结果 实验结果见下节课细胞复苏后可观察到。