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细菌性疫苗制造技术 任务一 灭活苗的制造流程 菌种的选择（强毒株) → 菌液培养 → 灭活 ↓ ↓ 配苗（5 份菌液+1 份铝胶配苗) ← 浓缩 工序一 菌种与种子培养 选取毒力强、免疫原性好的 1～3 个品系菌株，按规定定期复壮和 鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为 种子液。种子液保存于 2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子 使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着 物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首 先对大肠杆菌进行分离 鉴定，符合要求方可作为菌种使用。 工序二 菌液的培养 用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等 方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液 体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬 液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量 小。因此，大 量生产疫苗时常用液体培养法。 实例 大肠杆菌的菌液培养方法 (1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼 脂平板上，置 37℃温箱中培养 18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂 斜面，置 37℃温箱中培养 18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可 作为种子培养物。 (2)．取 5ml 马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭 菌吸管按 5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置 37℃培养 18～ 24h 后作为二级种子。 (3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步 扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养 24～48h 后，加入 灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的 离心管中，低速离心 5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。 吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振 荡 30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其 余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。 如接种于马丁肉汤培养基，经 37℃培养 24～48h 后，直接取少量 菌液供计数用，其余细菌则灭活。 工序三 菌数计算 采用活菌计数法或比浊计数法，以概略地计算出每毫升菌液中的 细菌总数。 工序四 灭活与浓缩 对大肠杆菌菌液应加入 0.5％甲醛溶液，置 37℃温箱作用48～72h， 以达到杀死细菌的目的。灭活后需对菌液进行浓缩，常用的浓缩方法有 离心沉降法 氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法。可使菌液浓 缩 1 倍以上。 工序五 配苗与分装 配苗就是在菌苗的制备过程中加入佐剂，以增强免疫效果。由于灭 活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不同。例如,大肠杆菌氢氧化 铝菌苗细菌计数所得原菌液的浓度，用灭菌生理盐水将其稀释成最终 浓度为 100 亿～400 亿个/ml 。按每 5 份菌液加入 1 份氢氧化铝胶配 苗，同时加入 0.01%硫柳汞，充分振荡，置 2～8℃静止 2～3d，抽弃上 清液，浓缩成全量的 60%。塞上胶塞，用固体石蜡溶化封口，贴上标签， 注明菌苗名称。使用前充分摇匀。,整个制备过程都必须在无菌条件下 按照无菌操作进行 介绍常用灭活剂 1.甲醛 甲醛是最古典的、也是应用最广的一种灭活剂。为无色气体，易 溶于水和乙醇，其 36％～40％水溶液称为福尔马林。 甲醛用于疫苗灭活的浓度为 0.1％～0.5％。一般需氧细菌用 0.1％～0.2％的浓度，厌氧菌则多用 0.4％～0.5％的浓度。病毒可在 0.05％～0.4％的之间，多数使用 0.1％～0.3％。 2.苯酚 又称石炭酸。为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及 腐蚀性，易潮解，溶于水及有机溶剂。置于空气中易被氧化，应避光保 存。 灭活机制是使微生物的蛋白质发生变性和抑制特异酶系统（如脱 氨酶、氧化酶等）的活性，从而导致微生物死亡。制作生物制品的常用 浓度为 0.3％～0.5％。 3.β-丙内酯 又名为羟基丙酸-β-内酯，性状为不稳定，无色，有刺激 气味的液体，是一种良好的病毒灭活剂。