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肿瘤干细胞培养技术 随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成 为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领 域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以 对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为 肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。 肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其 分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿 瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得 到肿瘤干细胞使用无血清培养基在 37℃，5％CO 饱和湿度的条件下 2 进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好， 最好是在外科手术后 1 小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞 的活性，不利于体外培养。 无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营 养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明 确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配 方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生 长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系 (株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及 附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有 DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM 、神 干细胞专用无血清培 养基、黑色素瘤专用培养基等其中以 DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为 常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营 养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋 白、B27、L －谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、 成纤维细胞生长因子、神 生长因子、血小板衍化生长因子等。使用 无血清培养基培养的细胞 胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的 作用，可使用 0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。 一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一) 白血病抑制因子 LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介 素 6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多 种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促 进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加 LIF 以抑制其分化， 维持其多能性。LIF 可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth Factor ,TGFβ)和 叶酸(Retinoic Acid ,RA)诱导的细胞分化。 (二)干细胞因子(stem cell factor,SCF) 又称肥大细胞生长因子 (MGF)，Kit 配体(KL)及 Steel 因子(SLF)，SCF 可以诱导干和祖细胞增 生。SCF 主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓) 中的基质细胞、 成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。SCF 是一种作用于最早期造血 干祖细胞的造血细胞因子，在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细 胞增殖和分化、调控各系造血细胞的生长发育过程中起着重要作用。 (三)表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 是含有 53 个氨基 酸的多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长的作用,是表皮细 胞培养的最常用的添加因子之一。EGF 可显著促使细胞分裂、增殖，在 一定浓度范围内(5~20ng/ml),随 EGF 浓度提高,效应加强。 (四)碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 1975 年 Gospodarowicz 及其同事从牛大脑和垂体中分离纯化出一种 分子量为 16-18kD 由 146 个氨基酸组成的