化疗药物体外诱导急性髓系白血病细胞凋亡的临床意义.docVIP

???? 化疗药物体外诱导急性髓系白血病细胞凋亡的临床意义 ???? ????　我们采用TdT介导的脱氧核苷酸切口和缺口末端标记法（TUNEL）及超微结构观察等方法，对18例初治急性髓系白血病（AML）患者骨髓白血病细胞进行体外化疗药物诱导凋亡与临床疗效关系的初步研究，以探讨体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡在临床化疗疗效预测中的实际应用价值。 病例和方法 1　病例和标本　18例初治AML患者来自第二军医大学长海医院血液科和上海医科大学华山医院血液科。其中男8例，女10例；中位年龄46 岁（14～70岁）； M1 1例，M2 9例，M31例，M4 4例，M5 2例，M7 1例。所有患者均经形态学、细胞化学（M7经电镜及单抗）检测确诊。化疗采用HA（高三尖杉酯碱2～4mg/m2、阿糖胞苷100～150mg/m2）、DA（柔红霉素40mg/m2、阿糖胞苷100～150mg/m2）方案。完全缓解（CR）与未缓解（NR）判别按国内现行标准。化疗前抽取新鲜骨髓, 抗凝,用分离液分离单个核细胞备用。2　化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡　单个核细胞浓度为1×106/ml, 分别孵育于①高三尖杉酯碱(HHT)2mg/L,②柔红霉素(DNR)1.0μmol/L，③阿糖胞苷(Ara-C) 1.0μmol/L，④HHT(2mg/L)+Ara-C (1.0μmol/L)，⑤DNR (1.0μmol/L)+Ara-C (1.0μmol/L)，作用18h。以上药物终浓度的选择参考万景华等［1］的方法及我们的实验结果。3　白血病细胞bcl-2表达检测　所用单抗bcl-2（124）购自上海华美公司（丹麦DAKO公司产品）。HRP-DAB药盒购自美国Labvision公司。细胞涂片（细胞浓度为2×106/ml）后丙酮固定，过氧化氢作用后微波抗原修复。加bcl-2单抗，37℃湿盒作用30min，加生物素化二抗,室温作用10min，加辣根酶标记链霉亲和素工作液（Streptavidin/HRP）室温作用10min，最后以3,3′-二氨基联苯胺(DAB)染色。计数1000个细胞中的阳性细胞，并计算其阳性率。参照10例良性血液病患者的结果，bcl-2表达15％为阳性。4　凋亡检测4.1　 Wright-Giemsa染色: 细胞离心涂片染色,光镜下计数具有明显凋亡特征的细胞(细胞缩小, 核染色质凝聚,核碎裂等)。4.2　TUNEL法检测片段化DNA: 主要步骤为用体积分数为1%的甲醛固定细胞,以Triton X-100穿透细胞,洗涤后滴片, 晾干。用dUTP-荧光素标记试剂盒(购自德国保灵曼公司上海分公司)进行温育反应(每份标本均设立阴性对照, 即不加关键的TdT酶)。然后加抗荧光素-AP, 再加底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)和氯化硝基四氮唑蓝（NBT)，将基于荧光素的TUNEL检测转化为显色法。阳性细胞被染成蓝黑色。计数1000个细胞中阳性细胞数，并以骨髓分离后白血病细胞比例作校正。4.3　透射电镜标本制备: 细胞用PBS洗涤后,用戊二醛和锇酸固定后进行漂洗、脱水、包埋、超薄切片，染色并晾干后以透射电镜观察细胞内超微结构。5　统计学分析　实验数据分析采用两样本均数比较的t检验及t′检验。 结果 1　化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡　结果见表1。 表1　AML患者化疗前体外化疗药诱导白血病细胞凋亡率(%,0102 (84 字节) src=/med/cano/201003/20100316190505149 11 15±s) 组别 例数 HHT DNR Ara-C HHT+Ara-C DNR+Ara-C CR组 11 　 Wright-Giemsa染色 　 28.1±2.5* 35.8±6.4* 33.9±4.2* 36.1±5.5* 42.1±7.9* TUNEL法 　 39.3±9.7* 45.0±9.4* 40.7±5.7* 40.7±9.3* 53.3±7.5* NR组 7 Wright-Giemsa染色 　 21.0±2.3 17.9±5.0 22.7±4.7 21.1±2.3 22.6±3.0 TUNEL法 　 24.6±2.7 23.3±4.2 26.4±7.4 26.7±4.0 27.3±3.9 ???? 　　注:与NR组比较，*P0.05 　　表1结果表明, CR患者化疗前白血病细胞体外对化疗药物的敏感性均高于NR患者（P值均0.05）。在所有的实验组中，TUNEL标记法的敏感性普遍高于Wright-Giemsa染色法。2　白血病细胞bcl-2表达与体外化疗药物诱导凋亡及临床疗效的关系　结果见表2。 表2　白血病细胞bcl-2表达与体外化疗药物诱导凋亡及临床疗效的关系 例号 性别 年龄(岁) 诊断 bcl-2表达