第八节高效液相色谱学习资料.pptVIP

第八节 高效液相色谱 一、概述 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)，又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。 ;二、高效液相色谱原理 　高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）;三、HPLC的特点 HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。 1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。 2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。 ;高效液相色谱系统;;液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph;液相色谱仪（2）;液相色谱仪（3）;四、HPLC的分类 HPLC可以分为很多类别，按分离机制可分以下几种主要类型。 1.液固吸附色谱 以吸附剂为固定相，以不同极性的溶剂为流动相，根据试样中各组分吸附能力的不同而进行分离的方法，称液相吸附色谱。在HPLC中常用全多孔型硅胶微粒为吸附剂，直径5-10μm，由于颗粒小且多孔，故柱效很高。 2.液-液分配色谱 流动相与固定相均为液体的色谱法，称液-液分配色谱法或简称液- 液色谱法，按照固定相和流动相极性的差别，可分为正相与反相色谱法两类。 ; (1) 正相液液色谱法 流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。洗脱时，??性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分在固定相中溶解度大，后流出色谱柱 。 原始的正相色谱以含水硅胶为固定相，以烷烃等为流动相，由于固定液易流失，已被化学键合相色谱法取代。化学键合相是将固定液用化学键键合在载体表面形成的固定相。正相色谱常用的氰基键合相，性质与硅胶类似，只是保留时间略小。氨基键合相的氨基为碱性，与硅胶的性质差异较大，常用于糖类的分析。 正相色谱以有机溶剂为流动相，使用成本较高。 ;(2) 反相液-液色谱法 流动相极性大于固定相的液-液色谱法称反相液-液色谱法，洗脱时样品中极性大的组分先流出色谱柱。为了防止固定液的流失，反相色谱法均使用化学键合相，典型的反相化学键合相，用多孔性载体上化学键合的十八烷基(octadecysilyl,缩写ODS 或C18)为固定相，流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，由弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相构成。 反相键合色谱法固定相不流失，流动相以水为主，用甲醇或乙腈调节极性，应用范围很宽，且使用成本低，在HPLC中应用最广。 ;1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性 固定液——非极性 3．正相色谱——固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分,流动相为正己烷等。 反相色谱——固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分，流动相主要为甲醇或水的溶 液等，;五、HPLC的仪器构成 高效液相色谱仪通常由溶剂输送系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录系统四部分组成。 1.高压泵：由于HPLC的固定相颗粒很小，柱阻力很大，故载液必须用高压泵来输送，通常柱前压达15-30MPa，才能获得高速的液流，以达到快速分离目的。载液要预先脱气，流路中不应产生气泡，并要避免尘粒，以免堵塞泵和柱子，故使用前载液常在减压下通过0.45μm的滤膜进行过滤和脱气。有时还用梯度洗脱装置，使载液的组成(浓度、离子强度、极性和pH值)随时间而连续改变，以提高色谱分离的效果。 ; 2.进样系统：为