第九章酵母菌遗传.pptVIP

酵母双杂交的实验流程 构建诱饵质粒（X-BD) 将质粒转化酵母菌 检测X-BD蛋白在酵母中的表达 通过酵母生长曲线检测X-BD是否有毒性 进行自激活测试 将文库质粒共转化入X-BD-酵母 筛选阳性克隆子（四缺，x-gal显色反应） 共转化再次确认相互作用 将阳性克隆子在二缺平板上划线3次 提取酵母质粒，转化E.coli，提取质粒 PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子 DNA测序 NCBI数据库搜索 酵母双杂交结果 X-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析 酵母双杂交测序结果 酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子. GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端, 含有几个锌指结构, 可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS); 而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性. 在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。 通过把两种感兴趣的蛋白质中的一个与Gal4 DNA 结合区融合，另一个与激活区融合，可检验这两种蛋白质是否在细胞中发挥相互作用。如果这两种蛋白质在细胞内具有相互作用，那么Gal4 就会装配成一个具有活性的类似于转录因子的结合蛋白，在它的激活作用下，Gal1 启动子打开。若将lacZ 报告基因置于Gal1 启动子的控制下，通过直接测定β-半乳糖苷酶的活力或利用培养基中加有X-gal 的方法可检测到起相互作用的另一种蛋白质。 报告基因常为lacZ和His3 。常用的DNA结合域有Gal4 DB、LexA DB(来自大肠杆菌)，转录激活域有Gal4 AD、B42 AD(大肠杆菌酸性激活域)、VP16 AD (单纯疱疹病毒的转录激活域)。 UAS Gal1 LacZ UAS Gal1 His3 on on P1 P2 P1 P2 P1 + P2 = Interaction P1+DBD fusion P2+AD fusion protein SC-Try-Lue-His- X-gal 能生长，且为兰色菌落 UAS Gal1 LacZ UAS Gal1 His3 off off P1 P2 P1 P2 P1 +P2 = No Interaction 不能生长，即使生长也是白色菌落 SC-Try-Lue-His- X-gal 举 例 酵母双杂交前准备工作 双酶切验证 21kb 5kb 3.5kb 2kb 1.5kb M 1 M:marker 1:pGBKT7-BD-X 构建诱饵质粒 诱饵蛋白的表达 X-BD Gal4-BD 检测诱饵蛋白是否有毒性 1 2 3 Western blot 1.Yeast 2.BD-yeast 3.X-BD-yeast 酵母生长曲线 1.未转化酵母 2.BD-酵母 3.X-BD-酵母 SD/-Trp/-Leu -Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM） 举 例 SD/-Trp/-Leu -Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM） X-BD+Y-AD Gal4-BD+Gal4-AD Gal4-BD+Y-AD X-BD+Gal4-AD 接合型转换是一个单向的过程，在这个过程中有一个接受者(MAT)，却有两个供体(HMR、HML)。a型细胞通常选择HML为供体，α型细胞选择HMR 为供体。 当基因型是HMLa和HMRα时，92%的取代是同源的，一个a 被另一个a 所取代，一个α被另一个α取代，因为供体的选择并不关心沉默位点的内容。 HO在G1期的限制性表达确保在MAT基因被复制之前就发生接合型转换，结果导致两个后代有相同的新接合型。 转换只发生在母细胞中； HO基因的转录受几种调控影响： ① HO的转录受接合型基因的调控，它不在MATa／MATα 二倍体细胞内合成。 ② HO在亲代细胞里而不是子代细胞被转录。 ③ HO的转录也与细胞周期相关，该基因只在亲代细胞G1 期末表达。 3. HO的表达调控 调控HO 基因的顺式作用位点位于基因上游1500bp 处。 接合型的调控和其它单倍体特异性基因的调控相似