2019年8目的基因的克隆.pptVIP

基因克隆的一般流程 基因的获得 PCR RT-PCR 载体 连接 准备感受态细胞 转化 重组子筛选 下游工作 载体的选择 ? 基因工程载体一般要求： ? 能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 ? 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 ? 合适的多克隆位点（ MCS ）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细 胞和在细胞中的复制。 ? 易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。 ? 有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都 能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。 ? 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等 重组 DNA 技术的一般流程 ? 目的 DNA 的获得 ? 目的 DNA 与载体的连接 ? 重组子导入受体细胞 ? 重组子的筛选和鉴定 实验一 : pEGFP- NGF 质粒载体的构建 ? NGF 基因的克隆 ( T-A 克隆 ) NGF-sense: a GAGCTC aag atg ctgtgcctcaagccagt NGF-antisense: at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg 5 6 pEGFP 荧光质粒表达载体 质粒 DNA 的酶切反应结果 质粒 M 酶切反应 M 酶切反应 pEGFP pT-NGF 酶切产物凝胶回收操作步骤 （ Gel Extraction Kit ） ? 仔细切下含 DNA 的凝胶，置一称重的 1.5ml 离心管中。称重。 ? 按 300 ? lS1 溶液 /100mg 凝胶加入的比例加入 S1 溶液，置 50 ℃水浴 10 分钟， 使凝胶完全溶化，每 2 分钟颠倒混匀一次。 ? 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中， 9000g × 30 秒，倒掉收集 管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 ? 在吸附柱中加入 500 ? l W1 溶液， 9000g × 15 秒，倒掉收集管中的液体，再 将吸附柱放入同一收集管中。 重复一次洗柱。 ? 将吸附柱放入同一收集管中。 9000g × 1 分钟。 ? 将吸附柱放入一新 1.5ml 离心管中，在吸附膜中央加入 30 ? lddH2O ，静置 1 分钟， 9000g × 1 分钟。备用。 重组子的筛选 ? 耐药性基因 外源质粒赋予宿主抗生素抗性 ? 蓝白斑筛选（ ? 互补现象） lacZ ＋ plasmid 和 M15 △ cell strain 关于连接酶 ? 定义： ATP 存在下，在 3 OH 和 5 P 之间形成磷酸二酯 键。 ? 特性：连接粘端的效率远高于平端。 ? 策略： 1. 首选不匹配粘端 2. 次选匹配粘端，载体脱磷 3. 平端连接，延长时间，提高酶量 平端连接图示 匹配粘端连接图示 不匹配粘端连接图示 连接反应的建立 ? 连接反应的温度： ? 粘性末端，按 A-T ， G-C 含量计算，± 5 ℃。 ? 如 Pst I （ CTGCA ↓ G ， 12 ℃ ）， EcoRI （ G ↓ AATTC ， 8 ℃）。 ? 平末端，如 EcoR Ⅴ（ GAT ↓ ATC ），可在室温进行，不超过 30 ℃， 酶的用量要比粘性末端加大 10-100 倍 。 ? DNA 量： ? 摩尔数之比 载体 : 目的 DNA ＝ 1 : ( 1~3 ) 载体摩尔数 目标基因片段碱基数×载体重量 目标 DNA 摩尔数 目标基因片段重量×载体碱基数 载体和目标基因的连接反应 ? 如未定量可以 按回收效率 75 ％ 计算 DNA 浓度，按载体与 目的基因 摩尔数比 1:3 进行连接。 ? 连接反应在灭菌的 0.5ml 离心管中进行。 15 ? l 体积反 应体系中： 加 ddH2O 使终体积为 15 ? l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15- 30 ng 10 × Ligas