第十章高效液相色谱法2知识讲解.pptVIP

第十章 液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography) ; 高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自动化 操作。;高效液相色谱; 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。 ??分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。; 液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 ;二、液相色谱与气相色谱的比较; 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析； 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 ~ 80%。 ; 因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。 ;②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。;（3）由于液体的扩散系数比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。 液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。; 综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 ;现代液相色谱和经典液相色谱比较没有本质的区别 不同点: 仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自化 操作。;10.2高效液相色谱仪;手执控制器;贮液器;高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统; 10.2.1、高压输液系统;关于溶剂;;脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的 气泡 气泡对测定的影响： 1）柱流量不准 2）检测器基线波动 脱气注意点： 1）每天脱气(无在线脱气器时） 2）混合溶剂脱气时间不能过长;;在线真空脱气机; 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。;泵的注意事项; 10.2.2、进样系统;; 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：;;样品要干净、经过过滤。 合适的进样体积，比如定量环为20ul，进样体积应为0—10ul，或者20ul，进样20ul时注射样品量应至少60ul以上。 定期清洗进样阀，清洗过程如下： 1，将进样阀旋至Inject位置； 2，用带有专用头的注射器用纯水约20—30ml冲洗进样阀； 3，将进样阀旋至Load位置。;自动进样器; 10.2.3、分离系统; 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 ;;使用色谱柱注意事项： 1 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤,防止堵塞。 2 加前置柱。 3 更换流动相要渐变。 4 用后要保护好。;;关于恒温柱箱; 10.2.4、检测系统;HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。;缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相