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酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究 作者 摘要 关键词 一． 实验目的 1. 认识生物体中酶的存在和催化作用，便于我们了解生物 体系中酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之 处，认识一些生物化学过程的特殊性。 2. 掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使 仪器分 析的手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思 想和方法。 二． 实验原理 许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压 等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下， 如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行， 其根本原因就是由于生物酶的存在。 生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是 简单蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结 合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能 表 出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。 例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。 通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个 或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析 工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生 化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机 成分，用其他方法测定有困难， 酶法分析却有其独到之处。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹 果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的 象是人们都见过的， 这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在 空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应 过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率 则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化 反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在 不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所 得的直线斜率求酶的活性。 其反应过程如下 图所示 酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括 pH 值、离子 强度、温度等），25℃时在 1min 内转化 1mol 底物所需要催化剂的量 为活性单位。通过下式可计算酶的活性：a  A 106 ，式中，a 为所 kt V 溶液的酶的活性， 为最大吸收波长吸光度的变化，t 为时间（min），  A k 为多巴红的摩尔吸收系数，V 为加入酶的体积，进而计算出原料（土 豆）中酶的活性：A a V / m 。式中 A 为原料中酶的活性（注意此处 A o 不是吸光度 A ），V 为原料所得的酶溶液的总体积，m 为原料总质量。 0 三．实验仪器与试剂 1、仪器：分光光度计、离心机、研钵、水浴、秒表 2、试剂：二羟基苯丙胺酸（多巴）、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、 土豆 四．实验步骤 1.溶液配制 0.10mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.2）：50ml 0.20mol/L 磷酸二氢钠 +8ml 0.1mol/L 盐酸，定容至 200ml ； 0.10mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=6.0）：50ml 0.20mol/L 磷酸二氢钠 +22ml 0.1mol/L 盐酸，定容至 200ml ； 0.10mol/L 多巴溶液：0.195g 多巴， pH=6.0 的磷酸缓冲溶液定 容至 100ml（ 配）。 2 酶的提取 取新鲜土豆，清洁后切碎，称取 10.0g 置于研钵中，加入 7.5m