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流式细胞仪培训报告 培训时间：2009年3月16日至31日 培训内容 开关机 流式图的阅读 细胞周期检测 单、双抗标记检测 分选 日常维护 流式细胞仪 流式细胞仪(Flow Cytometer， FCM): 是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。 流式细胞术 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM): 是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。 流式细胞术的优势 多参数测量和分析（散射光和荧光） ； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群,单细胞克隆等。 快速测量和分析 每秒可达1000-10000个细胞(5000) 分选纯度可达99%以上。 流式细胞术的优势 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。 也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒， 获取的数据分析结果更具有统计学意义； 流式细胞仪与荧光显微镜比较 流式细胞仪的测量对象 大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：0.2uM-300uM。 对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、其它细胞器以及乳化微球等。 本中心仪器型号 Beckman Altra AJ20016 大型机，可做检查和分选 488nm 633nm激光 带水冷系统 安置于专门层流间，基本保证恒温、无菌、无尘 光路系统： 激光光源，光路系统（透镜、滤光片） 电子系统：光电倍增管（PMT），补偿电路 液流系统： 鞘液系统，样品流动系统 数据系统：计算机，数据测量和分析软件。 细胞分选系统 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 最多检测13个荧光参数 FCM仪器分为二大类 台式机 ：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。 大型机： 细胞分选 可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。 FACSCalibur 流式工作原理(一) 用一定压力将待测样 品压入流动室，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 流式细胞仪工作原理 散射光信号 前向角散射光（FSC,FS, Forward Scatter） 入射光的前向 (5?)散射光信号, 可反映：细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC,SS, Side Scatter） 入射光90?角的散射光信号， 可反映：细胞颗粒性程度 （胞内成分和构造和表面结构的复杂性） 前向角散射与被测细胞的大小有关，确切地说，它与细胞直径的平方值密切相关。通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 流式细胞仪的电子系统 信号检测和分析 当细胞携带荧光素, 通过激光照射区, 受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号， 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析 流式细胞仪可检测的细胞参数 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度 特征信息－荧光信号 荧光素吸收激光（激发光波长）能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长） 荧光素与特异抗体结合（荧光抗体） 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强 荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量 荧光素种类 FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP (多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 6