免疫组化实验课知识课件.pptVIP

免疫组化原理 抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。 设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。 对照染色的目的 假阴性的原因主要有： ①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽； ②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）； ③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。 免疫组织化学实验课计划 赵坤庆 赵清杰 中国科学院动物研究所 Email：zhaokq@ioz.ac.cn zhaoqingjie11@mails.gucas.ac.cn 实验一 实验动物取样、固定与保存（4学时） 实验室规章制度及实验室安全讲解 学生分组 分小组配置相关溶液：操作 动物的致死法及取材: 操作 细胞标本的制备：操作 尸体解剖的取材：讲解 活检标本的取材：讲解 组织样品的固定：操作 实验室规章制度及实验室安全 ⑴ 熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在危害。 ⑵ 检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。 ⑶ 工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，不得盲目操作。 ⑷ 不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、亲友带进化学实验室。 ⑸ 必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。 ⑹ 熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位置、急救电话。 ⑺ 保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。 ⑻ 实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。 ⑼ 离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和休息室等。 ⑽ 遇试剂溢出，应当立即清除。如溢出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员并封闭现场，立即报告室主任和安全部门。 ⑾ 保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实验后进行。 ⑿ 做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所“过夜实验管理办法”执行。 ⒀ 及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、生物废弃物。每周在指定时间送往指定地点。 ⒁ 实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使用明火。 ⒂ 工作时间之外，任何人都不允许在实验室单独操作大型仪器和危险化学品，或单独处于具潜在危险的场所。 分小组配置相关溶液 1 配制10XPBS及1XPBS 10×Phosphate Buffered Solution（PBS）(pH 7.4) ： Reagent Weight Final concentration NaCl MW=58.44 81.816 g 1.4 M KCl MW=74.55 2.01 g 27 mM Na2HPO4·12H2O MW=358.14 35.8 g 100 mM KH2PO4 MW=136.09 2.45 g 18 mM H2O Up to 1000 ml 注：1000 ml溶液用约1ml 10 M NaOH调节pH值至 7.4。因为实验室所用蒸馏水、三蒸水和去离子水的本底pH值有一定差异，加之NaOH可能由于放置时间而产生pH值的变化，故实际用量需根据情况调整。 2 配制1N HCl，1N NaOH 3 配制组织固定液：4% PFA 4 配制热修复液：Tris-EDTA 5 配制梯度酒精：75%， 85%，95% 6 酒精：二甲苯=1:1 7 石蜡：二甲苯=1:1 分小组配置相关溶液 动物的致死法 动物处死方法： 1.麻醉法 乙醚或4％戊巴比妥静注 2.空气栓塞法 3.断头法 4.断颈法 5. 二氧化碳窒息法 病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC 检测的关键。 尸检组织的取材 抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。 组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。 手术切除标本的取材 1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。 动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。 2.注意防止人为因素的影响  刀和剪要快，刀要足够长。 3.组织块的大小  厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定 4. 组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定 5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、