基于转录组与小RNA测序的库尔勒香梨病毒检测.pdfVIP

摘要 目的：通过高通量测序技术对库尔勒香梨花朵进行转录组测序和Small RNA 测序，筛选出与植 物病毒相关的基因序列作为候选病毒分析，并通过RT-PCR 技术对筛选到有关病毒的基因序列进行 验证。探索分析库尔勒香梨病毒的基因序列相关信息的新方法，为库尔勒香梨病毒的检测、病毒防 治和培育无病毒苗木奠定基础。 方法：将2014 年、2017 年、2018 年4 月中旬，采集的库尔勒香梨花朵分别于当年送至诺禾致 源公司，委托其利用Illumina HisSeqTM2500 测序平台进行转录组测序。将获得的原始序列过滤剔除 低质量数据得到干净序列后，采用Trinity 软件对干净序列进行拼接。Trinity 拼接得到的转录本序列， Corset 利用比对到转录本的序列和表达模式对转录本进行层次聚类，以Corset 层次聚类后最长Cluster 序列进行基因功能注释，筛选出注释为植物病毒的长片段序列作为候选病毒，对候选病毒病毒序列 设计引物进行RT-PCR 验证；将2014 年所获得的小RNA 测序数据，所得的原始序列进行测序数据 过滤，得到的为干净序列。在 NCBI 的 GenBank 数据库下载各种植物病毒的参考序列，将干净序 列用本地BLAST 程序与核酸数据库、蛋白数据库进行比对，筛选出和植物病毒序列相似性比较高的 序列，从而得到候选病毒进行分析。研究结果如下： 1、库尔勒香梨转录组测序分析 根据三组转录组测序数据的生物信息学分析结果，对分别筛选出的66 条、202 条、921 条注释 为植物病毒的基因序列和 1 条注释为植物类病毒的基因序列分析，发现有3 种是已报道的侵染梨的 病毒和 1 种类病毒，分别是苹果茎痘病毒分离物PA66 、苹果茎沟病毒分离物P-209 、苹果茎沟病毒 韩国分离物、苹果褪绿叶斑病毒、啤酒花矮化类病毒，一种未报道的病毒芸薹黄化病毒。根据设计 的特异性引物，随机采集的库尔勒香梨枝条样品利用RT-PCR 技术对筛选出的4 种病毒进行扩增验 证，只有苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒扩增出目的片段。 2 、库尔勒香梨Small RNA 测序分析 运用BLAST 程序将获得的干净序列分别与NCBI 的核酸数据库和蛋白质数据库进行比对，筛选 出了22 条注释为植物病毒的基因序列和32 条注释为植物类病毒的基因序列进行分析，发现2 种已 报道的侵染梨的病毒和 1 种类病毒，分别为苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果锈果类病毒。 关键词：库尔勒香梨；转录组测序；Small RNA 测序；病毒 I Abstract Object: The objective of this study was to use high-throughput sequencing to perform transcriptome and small RNA sequencing of Korla fragrant pear flowers, the gene sequence related to plant virus was selected as candidate virus analysis, and the gene sequence of the virus was screened by RT-PCR technology. Explored a new method to analyze the genome sequence information of Korla fragrant Pear virus, and lay a foundation for the research of Korla Pear virus detection, virus control and breeding of virus-free seedlings. Methods: The Korla fragrant pear flowers collected in mid-April 2014, mid-April 2017, and mid-April 2018 were sent to Novogene compan