第八章9聚焦色谱.pdf

第九节 离子交换聚焦色谱 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 色谱聚焦（chromatofocusing ）: 是一种高分 辨的新型的蛋白质纯化技术。是根据蛋白质 的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱， 能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦 效应浓缩，分辨率高。 适用水溶性的两性分子，如蛋白质、酶、多 肽、核酸等。 2 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 一、色谱聚焦的原理 （一）自动形成pH梯度。 （二）蛋白质的色谱行为 （三）聚焦效应 3 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 pH梯度溶液的形成 在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂 时，由于交换剂带有缓冲能力的电荷基团， 故pH梯度溶液可以自动形成。 4 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 PBE94柱聚焦色谱的pH梯度 （1）柱内每点的pH值 从高到低逐渐下降。 （2）从层析柱顶部到 底部就形成了pH6～9 的梯度。 （3）pH梯度会逐渐向 下迁移。 （4）底部流出液的pH 由9逐渐降至6。 5 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 蛋白质的色谱行为 当柱中pH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，不与阴离 交换剂结合,随洗脱液向下移动 。 当蛋白质移动至环境pH高于其PI时，蛋白质由带正电荷变 带负电荷，并与阴离子交换剂结合。 由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于PI时， 它又带正电荷，并从交换剂解吸下来而下降 。 移至pH大于PI时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出。 不同蛋白质具有不同的等电点，在被离子交换剂结合以前， 移动距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。 6 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 聚焦效应 当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等 电点处时，移动速度明显减慢。 此时加上相同的第二个样品，它将以洗 脱液移动的速度下降，直至追到正在慢 移的第一个样品（聚焦）。 如果加入的第二个样品的等电点比第一 个样品高，它可以越过第一个样品区先 被洗脱出来。 7 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 二、多缓冲剂 多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂，是分子 量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合 物。 Polybuffer96             PBE94 Polybuffer74             PBE94 8 第八章 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节