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小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 一、实验材料 主要仪器设备 倒置显微镜（Olympus，Japan） CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司） 100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂） 6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm） Eppendroff管 1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿 离心机 5ml冻存管 两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 主要试剂配制 MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ——低糖DMEM母液 用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）； 将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 搅拌直至完全溶解。 用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。 立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。 ——MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。 PBS 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO4 0.1g 于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g NaCl 0.7g Na2HPO4.12HO2 0.024g KH2PO4 0.024g KCl 0.037g Tris 0.3g D-葡萄糖 0.1g 酚红 1mg 于4℃过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在–10～30℃下冻存备用。 0.1%的明胶水溶液 称明胶0.1g （Sigma, G—9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121℃高压灭菌45min，于4℃保存。 10ug/ml的丝裂霉素C工作液 1) 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液 在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。 注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4℃避光保存。 2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液 在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37℃的CO2培养箱中预温30min.。 冻存液 取2支1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DMEM（低糖型）培养液和0.1ml二甲基亚砜（DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司），置40 动物： 性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。 二、实验步骤 获取小鼠胚胎 将8周龄的昆白♀鼠和12周龄的昆白♂按1:1比例合笼。 次日晨10:00前观察♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。 实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。 75％酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。 用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。 将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。 将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。 将