2015年实验三 间接ELISA.ppt

免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放 射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。 目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分 子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。 酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接， 然后通过酶与底物产生颜色反应， 产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有 3 种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂） 酶标抗体技术的基本程序 1 、将酶分子与抗原或抗体分子共价结合 2 、将酶标抗体 ( 抗抗体 ) 与吸附于固相载体上的抗原 ( 抗体 ) 发生特异性结合，并洗下未结合的物质 3 、滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或 者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢 体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变为有色 的氧化型，呈现颜色反应。因而，可根据底物溶液 的颜色反应来判定有无相应的抗原抗体反应。 间接 ELISA ? 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶 标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。 底物显色反应 抗原包被 一抗反应 二抗反应 基本流程 结果测定 一、抗原包被 ? 固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体 或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 ? 良好的 ELISA 板应该是 吸附性能好 ， 空白值低 ， 孔底透 明度高 ，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间 性 能相近 。 ? 蛋白质 与 聚苯乙烯 固相载体是通过物理吸附结合的，靠的 是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基 团间的作用。 ? 包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类 ? 包被条件 包被液 pH9.6 碳酸盐缓冲液 pH7.2 的磷酸盐缓冲液 pH7-8 的 Tris-HCL 缓冲液。 加入包被液后，在 4- 8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温 2 小时。 包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通 过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为 10ng/ml-20ug/ml 。 二、封闭 封闭 (blocking) 是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排 斥 ELISA 后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂： 0.05%-0.5% 的 BSA; 10% 的小牛血清或 1% 明胶 ; 脱脂 奶粉 , 比较价廉，可以高浓度使用（ 5% ）。 三、洗涤 在板式 ELISA 中，常用的洗涤液为含 0.05% 吐温 20 磷酸盐缓 冲液。 四、一抗反应 常用抗体：血清、单抗、体液等，常用封闭液稀释后使用 。 酶标记的抗抗体是 ELISA 中关键的试剂。常用辣根过氧化物酶（ HRP ）标记抗体。用封闭液稀释后使用。（ 2000-8000 倍稀释） 五、二抗反应 六、底物反应 HRP 的底物： 四甲基联苯胺 (TMB) ， H2O2 为受氢体。 TMB 经 HRP 作用后产物显蓝色。 TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与 H2O2 溶液混和即成应用液。酶反应终止后， TMB 产物由蓝色呈黄色，可在 比色计中定量，最适吸收波长为 450nm 。 常用的 HRP 反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异， 在板式 ELISA 中一般采用 2mol/L 。 七、 结果判断 ELISA 检测仪，读每孔的 OD 值。 A. 阳性判定值： （ cut-off value ）一般为阴性对照 A 值加上一 个特定的常数 (0.05) ，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。 B. 标本 / 阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定 的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（ S ）和阴性对照 （ N ）的 A 值后，计算 S/N 值大于等于 2 。 猪圆环病毒 2-dCap-ELISA 抗体检测试剂盒 用于检测猪血清中抗猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白抗体， 评价 PCV2 疫苗的免疫效果和感染猪的血清学诊断。 PCV 编码蛋白 电镜下观察 PCV