《医学生物化学与分子生物学实验教程》实验1小鼠血清IgG的Western blotting分析.docx

实验一：小鼠血清IgG的Western blotting分析 实验原理： 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blotting。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息.现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 1、第一部分： （1）SDS（polyacrylamide gel electrophoresis ） 即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是目前各生物医学实验室研究蛋白质最为常用的技术手段之一，SDS技术常用于对生物样品中蛋白质的组成进行定性、定量分析，蛋白质表观分子量测定，以及作为蛋白质印迹分析和蛋白质双向电泳分析的实验步骤之一。 （2）SDS电泳 蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同蛋白在不同pH下表现出不同的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS 与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构，同时使整个蛋白带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向正极泳动。 SDS浓度与分离蛋白质范围： 丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（kD） 15 10~43 12 12~60 10 20~80 7.5 36~94 5.0 57~212 蛋白样品处于 pH6.8 压缩胶的上层，pH8.8 的分离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连续，在浓缩胶泳动时，Pro-受阻小，在慢离子（Gly-）和快离子（Cl-）的共同作用下，不同蛋白质可在压缩胶上被压缩成一薄层，使全部蛋白质在进入分离胶前位于同一“起跑线”上；当蛋白质进入分离胶时 ，不同蛋白以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异， 最终达到彼此分开 。 2、第二部分：样品的印迹（转膜） （1）选择适当的膜并进行预处理： NC膜：价格便宜，能简单快速封闭非特异性抗体结合。剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液浸泡，使NC膜得到彻底浸润，一般5 分钟以上。 PVDF膜：有0.45um和0.2um孔径，价格昂贵，洗脱抗体后可再使用，与蛋白较硝酸纤维膜的结合能力强，背景较NC膜深。剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约 1-2 分钟。 （2）电流 1mA-2mA/cm2，通常 200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间。 目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间（h） 80140 8% 1.52.0 25 80 10% 1.5 15 40 12% 0.75 ﹤20 15% 0.5 3、第三部分：特异抗体与抗原（靶蛋白）结合、显色 转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot), 用于对蛋白质的进一步检测。封闭后，用针对目的蛋白的特异抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的目的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。 清洗后，再用适当标记的二抗处理（二抗是指抗一抗的抗体），与适当底物溶液反应后即可产生可见区带，指示目的蛋白的位置。 主要试验设备及材料： 实验设备：垂直板电泳装置、电泳电源、移液器级吸头、1.5ml离心管、吸量管、上样梳、手套、95℃加热器、尺子、电动摇床、染色脱色塑料盒、成套电转移装置、转移用大电流电源、滤纸、NC膜、剪刀、镊子等。 材料： 分离胶缓冲液、压缩胶缓冲液、40％丙烯酰胺胶液、4XSDS电泳上样缓冲液、10%过硫酸铵、SDS电泳电极液、TBS缓冲液。 转移电泳缓冲液（5L）：12.1g Tris、56.25g甘氨酸、1000ml甲醇，加蒸馏水至5L。 考马斯亮蓝染液。 封闭液：0.9%NaCl、0.05%Tween-20、5%脱脂奶粉、10mmol/L Tris-HCl，pH7.5。 漂洗液：150mmol/L NaCl、3mmol/L EDTA、0.05% Tween-20、50mmol/L Tris-HCl，pH7.5。 显色液：量取30mg氯苯酚，溶入10mL甲醇，再加入50mL TBS立即混匀，加入20uL过氧化氢，立即使用。 其他：预染蛋白Marker，小鼠血清、兔血清、抗小鼠IgG抗体、相应的辣根过氧化物酶标记、第二抗体、TEMED。 三、实验操作流程 实验时间安排： 第一天：1. SDS胶制备 2. 样品蛋白质含量测定 3. 电泳 第二天：1. 转移电泳 2. 蛋白质胶考马斯亮蓝染色分析 3. 膜封闭 4. 加一抗（过夜温浴4℃） 第三天：1. 洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色