《医学生物化学与分子生物学实验教程》实验4southern+blotting.ppt

化学标记法 利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。 酶促标记法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer labeling) 末端标记法 PCR标记法 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Denaturation Hybridization with random primer 5’ 3’ Klenow fragment α-32P -dNTP 5’ 3’ Denaturation 1.制备样品DNA 2.限制酶酶切DNA分子 3.电泳分离DNA片段 4.变性中和处理凝胶中的DNA片段 5.转膜 6.与探针杂交 7.结果显示 已做好 第一天 第二天 第三天 本实验采用实验一制备并保存的小鼠基因组DNA 1st 裂解 SDS 蛋白酶K 酚/氯仿 无水乙醇 离心 ①制备样品 DNA 一、小鼠基因组DNA制备 取3支1.5mL离心管，按照下表所列加组分加入相应试剂： 1 2 3 DNA溶液(20μg) x x x 10 X 缓冲液 10 10 10 dH2O 87-x 87-x 87-x 混匀后分别加入相应的酶 Eco RI 3 - - Bam HI - 3 - Hind III - - 3 混匀，37℃温浴，过夜 (一）基因组DNA的酶切 二、样品准备 (二）PCR扩增 以阳性重组质粒为模版扩增目的DNA(G6PD) 1. 样品准备： 取上述准备的样品上样，基因组DNA（20μL）\PCR （10μL） 、MARKER （5μL） 第一天 三、电泳分离DNA片段 MARKER 鼠基因组DNA酶切 PCR产物 每组 人基因组DNA酶切 MARKER 2. 电泳 调电压100V,电泳40分钟左右，紫外灯观察电泳结果，照相保存。 第一天 （为杂交做准备） 方法:随机引物标记法 用酶标亲和素进行检测 DNA 模版为纯化的PCR产物 第一天 四、探针标记 第一天 取一只1.5ml离心管： 加入100~1000ng模板DNA、10μL含引物的5×反应缓冲液，加水至44μl，混匀。沸水浴，5~10min。 立即转移至冰水浴，静置5min。4℃，离心10sec。 置冰水浴，依次加入下列试剂： 5μL生物素标记混合液、1μL Klenow片段（exo-） 混匀，37℃保温1~20h 探针标记 实验四 Southern blotting 1.掌握Southern blotting的原理和方法 2.了解探针标记的原理和方法 一.Southern blotting 二.探针标记 印迹技术 1975, Edwen Southern 分子印迹技术：将凝胶中分离的生物大分子转移（印迹/渍）到固相介质上并加以检测分析的技术。类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，故称blotting。 广泛应用于DNA、RNA和蛋白质的检测 类型 优点 缺点 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose,NC) 结合ssDNA、RNA和蛋白质的能力强；本底低；廉价；可用于微量制备 易碎、易皱缩；一般不能再次使用。需要特殊的程序才能结合RNA或小片段DNA 尼龙膜 （ Nylon ） 可结合DNA、RNA和蛋白质；检测敏感性高；柔韧性好；抗热抗溶解；不需要预浸湿 有些类型会出现较高的本底 其他载体膜：PVC膜，PVDF膜 转膜方法 用途 优点 缺点 毛细作用 可用于核酸、蛋白质 效果可靠、无需特殊设备 耗时长 电转移印迹法 可用于核酸、蛋白质 需时短 需要特殊设备 真空吸引转移法 仅用于核酸 需时短 效果差、需要特殊设备 中文名称 英文名称 应用 DNA印迹技术 Southern blotting 检测电泳分离的DNA RNA印迹技术 Northern blotting 检测电泳分离的RNA 蛋白质印迹 Western blotting 检测电泳分离的蛋白质 斑点印迹 Dot blotting 检测膜上未经分离的核酸 原位杂交 in situ hybridization 检测组织细胞中的核酸 核酸/蛋白质的制备 电泳 印迹 预杂交 杂交 洗膜 检测 DNA印迹技术 1975，Edwin Southern 又称为Southern 印迹(Southern blotting) 主要用于基因组DNA定性、定量分析 制备样品DNA DNA限制酶酶切 电泳分离酶切片段 凝胶中DNA变性 Southern转膜 Sou