《医学生物化学与分子生物学实验教程》（基因工程）.docx

实验报告（基因工程） 【实验目的】 1.掌握动物组织RNA提取的基本原理方法和RNA质量分析的原理。 2.掌握RT-PCR获取真核基因片段的原理和方法。 3.掌握真核基因原核表达的基本原理和方法。 4.了解蛋白质亲和层析纯化的基本原理和方法。 【实验原理】 基因工程又称基因拼接技术或DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译。本次试验即是运用基因工程的基本原理。先是提取小鼠脑组织中的总RNA,然后利用RT-PCR技术获得目的基因片段PKCε，经过酶切处理，将其与经特殊处理过的大肠杆菌表达质粒（含抗药性基因、GFP基因、6His基因）进行重组，导入到经过处理的大肠杆菌（感受态细菌）中，由于“重组体”（空载体或重组体）含有抗药性基因，导入了“重组体”的细菌可在含相应抗生素的培养基上生长，而没有导入“重组体”的细菌将不能进行克隆生长，借此可筛选出含“重组体”的细菌。此时的阳性克隆菌分别是含空载体的细菌和含重组体的细菌。载体质粒中含荧光蛋白基因，可表达荧光蛋白，在紫外灯下显示荧光，但荧光蛋白基因在重组体中位于目的基因(含有终止密码子）后，不能表达，所以可据此在紫外灯下鉴别出含空载体的细菌（显荧光）和含重组体的细菌（不显荧光）。但鉴别出的含重组体的细菌实际上有两种，一种是含正向重组体的细菌，即是我们需要的目的菌，另一种是含反向重组体的细菌，重组体有正向和反向之分是因为酶切目的基因和载体时所使用的是单一酶，造成目的基因既可以正向也可以反向拼接到载体上。重组体上含有3个HindIII的酶切位点，正向重组体和反向重组体经HindIII酶切后可各形成不同大小的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳显示后可区分两种重组体，最终得到需要的导入了正向重组体的目的菌。对于目的菌表达的目的蛋白(6His融合蛋白）的分离提纯采用固化金属离子亲和层析法，其具体原理是先通过固化于基质（常用为琼脂糖）的金属离子及其载体与带有6His标签融合蛋白结合，无His标签的蛋白理论上不与之结合，经洗脱液洗脱非特异性亲和蛋白后，再用高浓度咪唑溶液将带有6His标签融合蛋白从其结合的基质上洗脱下来，达到分离、纯化的目的。 【实验器材与试剂】 一、实验器材 剪刀、镊子、培养皿、烧杯、小塑料平皿、玻璃匀浆器、台式高速离心机、振荡器、移液器及吸头、PCR仪、烤箱、电泳电源、微波炉、紫外投射仪、紫外分光光度计、电泳仪、菌种、1.5ml离心管、掌上离心机、DNA电泳设备、恒温水域箱、已灭菌细菌培养皿、细菌培养管、恒温摇床、温箱、酒精灯、接种环、冰浴、紫外检测仪、振荡器、塑料盘、手套、摇床、照相设备等。 二、试剂 DEPC处理的蒸馏水、变性夜、DEPC处理的75%乙醇、TE缓冲液、10×MOPS缓冲液、EB液、RNAiso试剂、琼脂糖、甲醛、氯仿、异丙醇、0.5%SDS、RNA电泳上样液、一步法RT-PCR制备试剂盒、引物（用于PKC的ε亚型催化功能域基因片段）、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、载体质粒DNA、蒸馏水、10×限制性内切酶酶切缓冲液、10×连接反应缓冲液、氨苄西林、四环素、无水乙醇、His*Bind Resin、DNA分子质量标准物、3mol/L（pH5.4）、感受态细菌制备液、限制性内切酶BamHI、HindIII、T4 DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP)、SOB培养基、苯酚/氯仿、10×电泳DNA上样缓冲液、1×SDS PAGE电泳上样缓冲液、感受态制备试剂盒、4×SDS电泳上样缓冲液、MA培养基、含四环素及氨苄西林的MA培养皿、MA培养液1L、质粒提取液、含RNaseA的TE缓冲液、细菌裂解液、Charge buffer、Wash buffer、Elute buffer、固定液、致敏液、硝酸银溶液、显色液、终止液。 【时间安排】 第一天：1.小鼠脑总RNA的提取 2.RNA含量测定 3.RT-PCR 第二天：1.琼脂糖凝胶电泳检测RNA及PCR产物 2.感受态细菌的制备 第三天：细菌转化 第四天：1.小量质粒DNA提取 2.克隆的空载体DNA和重组体DNA限制酶切 3.选定克隆的菌液的离心处理和冻存 第五天：1.SDS胶的制备 2.纯化表达的6-His融合蛋白 3.电泳样品的制备 4.SDS电泳 5.琼脂糖凝胶电泳、鉴定质粒酶切产物 第六天：SDS胶的银染显示 【实验步骤】 从组织中一步法分离总RNA（第一天） 每实验台玻璃匀浆器中加入2ml的TRIZOL试剂置冰上待用。 取鼠脑：脱颈椎处死小鼠，取出小鼠大脑，均分四份，每份约0.2-0.3g。 匀浆：将一份脑组织立即移入玻璃匀浆器中，冰浴中研磨十次左右（至看不到组织块为止）。 4.提取脑组织RNA：①匀浆液平均转移入2只1.