《医学生物化学与分子生物学实验教程》Southern Blotting .docx

一、实验目的 掌握DNA印迹分析（Southern blotting）的基本原理和方法。 了解探针标记的原理和方法。 二、实验原理 （一）DNA印迹分析 将DNA分子用限制性内切酶消化为大小不同的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳，DNA片段被琼脂凝胶的分子筛作用按分子大小分离开；凝胶中的DNA片段经变性、中和处理后，经毛细作用转印到一个膜载体上（硝酸纤维素膜）。 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。 （二）探针标记： 与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 探针：是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有已知的序列，能够与待测的核酸片段互补结合以用于检测核酸样品中的特定核酸片段。 探针标记物： 放射性同位素：32P、3H、35S等 非放射性同位素：生物素(biotin)、地高辛(DIG)、荧光染料、化学发光剂。 探针标记方法： 按标记位置：末端标记（标记物位于探针的3’末端或5’末端）、均一标记（标记物位于探针内部） 按反应实质： 化学标记：标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。 酶促标记：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。包括：缺口平移法、随机引物法和末端标记法等。 结果检测方法： 化学显色反应、放射自显影、荧光检测等。本实验采用酶联生物素与显色剂氯萘酚反应，溶液颜色产生变化。 实验器材与试剂： 实验器材 离心管、42℃恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、移液器、水平式电泳装置、恒温浴槽、保鲜膜、塑料盘、镊子、剪刀、小塑料平皿、硝酸纤维素膜、封口机、恒温水浴箱等。 试剂 消化缓冲液、TBS缓冲液、苯酚/氯仿、20×DNA电泳上样缓冲液 变性液：1。5mol/L NaCl、0。5mol/L NaOH。 中和液：1。5mol/L NaCl、0。5mol/L Tris-HCl（PH 7。0）。 预杂交液：5×SSC溶液、1%SDS、5×Denhardt试剂、100ug/mL 鱼精DNA、50%甲酰胺。 封闭液：5%脱脂奶粉、0。9%NaCl、3mmol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl（PH 7。5）。 漂洗液：250mmol/L NaCl、3mmol/L EDTA、0。05% Tween 20、50mmol/L Tris-HCl（PH 7。5）。 显色液（临用前配制）：称取30mg氯萘酚，溶入10mL甲醇，再加入50mL TBS立即混匀，加入20uL过氧化氢立即使用。 10×限制性内切酶缓冲液，限制性内切酶 EcoR I、Hind II、BamH I。 其他：生物素探针标记试剂盒、辣根过氧化物酶标记链亲和素、7。5mol/L乙酸铵、0。25mol/L HCl、10mg/mL蛋白酶K、无水乙醇。 四、实验步骤 第一天 样品准备：①酶切（BamHⅠ）后的人类基因组DNA；②酶切（BamHⅠ）后小鼠基因组DNA；③G6PD基因经PCR扩增后所得DNA；④未进行酶切后的小鼠基因组DNA； ⑤Marker（DL5000）。 电泳分离： 保温期间，浇一块凝胶板：称取1g琼脂糖加100ml的1×TAE，微波炉低火加热1min使琼脂糖完全溶解，稍微冷却后，加GoldViewⅠ型核酸染色剂5。此为浓度为1%琼脂糖凝胶。缓慢将其倒入胶槽（样品梳应与胶槽底面保持约1mm间隙），倒胶时温度不宜过低，否则凝固不均，速度不宜过快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拔出样品梳，并不损伤梳底凝胶，然后向槽内加入0×DNA电泳上样液（10×Loading Buffer）。 将上述样品取样18加并加入210×DNA电泳上样液（10×Loading Buffer）予以混匀。 加样：一块凝胶共6个加样槽，从左至右依次为：Marker5、未酶切的小鼠基因组DNA20、未酶切的小鼠基因组DNA20、PCR后DNA10、酶切的人类基因组DNA20、酶切的小鼠基因组DNA20。 插上电源，负极在样品槽一遍，DNA向阳极跑，100V电压下电泳40min，直至溴酚蓝染料接近凝胶尾部。 观察和拍照：在波长为260nm长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。 转移前电泳胶的处理： 脱嘌呤：将琼脂糖凝胶块浸泡入10倍体积的0。25M HCL中振摇5min ，至溴酚蓝条带转变为黄色，继续振摇5min。 变性：去HCL溶液，加入10倍体积变性液，振摇20min；更换变性液，再振摇20min。 漂洗：去变性液，用蒸馏水漂洗一遍。 中和：加入5倍体积中和液，振摇20min，更换中和液，再振摇2