SDS-PAGE测定蛋白质分子量的基本原理,主要步骤.docVIP

SDS测定蛋白质分子量的基本原理和主要步骤 原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMr=K-bX，式中：Mr为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 实验步骤 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 5. 在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳。要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6.加样： （1）取10μl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量为10μl。 （2）取10μl样品溶液，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5μl和3μl。 7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散.为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样. 8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在20mA，当进入分离胶后改为30mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分. 实验结果及分析 1.绘制标准曲线，以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMr）为纵坐标，相对迁移距离为横坐标作图。 相对迁移距离=蛋白质分子迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm） 根据样品蛋白质分子的相对迁移距离，从标准曲线上查出其相对分子质量。