第3章蛋白质的性质及分离和纯化 2.pptVIP

蛋白质的沉淀作用 ? 蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子 聚集而从溶液中析出的现象。 蛋白质的沉淀作用 ? 等电点沉淀法 ? 中性盐析沉淀反应 ? 有机溶剂沉淀反应 ? 加热沉淀反应 ? 重金属盐沉淀反应 ? 生物碱试剂沉淀反应 1. 中性盐析沉淀反应 ? 盐析作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并中 和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这 种现象称盐析作用。 ? 机理：破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，因 而促使蛋白质颗粒相互凝聚而沉淀。 ? 盐溶作用：低浓度的盐可以使蛋白质溶解度增加， 称为盐溶作用。 ? 原因：低盐可以使蛋白质表面吸附某种离子， 导致同性电荷增加而排斥增加，同时与水分子 的作用也增强。 ? 盐析作用是由于当盐浓 度较高时，盐离子与水分 子作用，降低蛋白质极性 基团与水分子之间的作用， 破坏蛋白质分子表面的水 化层。 盐析沉淀的蛋白质 仍保持天然构象，即仍有 活性。 ? 盐溶作用是由于在盐浓度较低 时，盐离子被蛋白质分子吸附， 带电表层使蛋白质分子彼此排 斥，而 蛋白质分子与水分子间 的相互作用却加强了， 因而溶 解度增加。 ? 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同，其 水 化层厚度 不同，故盐析所需要的盐浓度也不 一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使 不同的蛋白质分别沉淀。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH 4 ) 2 SO 4 50% 饱和度 饱和 析出 析出 分 段 盐 析 2. 有机溶剂沉淀反应 ? 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水 互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水 的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化 层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 ? 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮 等。 ? 为了防止蛋白质在分离过程中发生变 性，有机溶剂浓度不能太高 (30%-50%) ， 而且需要在低温条件下进行。 3. 加热沉淀反应 ? 加热可以使蛋白质变性，常常可导 致蛋白质的沉淀，一般在等电点时 最易沉淀。 ? 应用：分离蛋白质时除去杂蛋白。 4. 重金属盐沉淀反应 ? 蛋白质在 pH 大于等电点时带负电荷，可以与 重金属离子结合，形成不溶性蛋白质沉淀。 ? 应用：抢救重金属中毒的患者 5. 生物碱试剂沉淀反应 ? 生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等 ? 蛋白质在 pH 小于其等电点时带正电荷， 可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋 白质沉淀。 ? 应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制 备 变性和沉淀的关系 ? 两者既有联系，又有区别： ? 变性蛋白质通常都是沉淀，但也有的不沉 淀。 ? 沉淀的蛋白质：有的变性，有的不变性。 蛋白质的分离纯化 ? 一、分离纯化的一般原则 ? 二、分离纯化的方法 ? 三、蛋白质分子量的测定 ①研究其结构与功能 ②工农业生产的需要 ③医疗业的需要 ④研究需要 ? (1) 破碎： ? 目的：把蛋白质从原来的细胞和组织中以溶解状 态释放出来，并保持活性。 ? 动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器 ? 植物组织和细胞：研磨或纤维素酶处理 ? 细菌：超声波震荡、与沙研磨、高压挤压或溶 菌酶处理 ? 如蛋白质在细胞的某个组分：差速离心，如细 胞核 前处理 ： 提取 ? (2) 抽提：目的是使蛋白质溶解 ? 根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提 ? 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， ? 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， ? 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 ? (3) 分离：目的是除去其它蛋白质等物，缩小体积。 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、 萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 ? (4) 纯化：目的是使蛋白质进一步纯化 可用层析法、电泳法等进行精制。 ? (5) 成品加工：真空冷冻干燥成成品。 ? 大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱 或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以 水溶液提取为主。通常采用类似生理条 件下的缓冲液，如 20-50 mmol/L 的磷酸 盐缓冲液（ pH7.0-7.5 ）或 0.1 mol/L Tris- HCl （ pH7.5-8.0 ）缓冲液作提取液。 根据蛋白质 溶解度 不同的分离方法 1 、蛋白质的盐析 2 、等电点沉淀法 3 、低温有机溶剂沉淀法 二 、 分 离 纯 化 的 一 般 方 法 根据蛋白质 分子大小 的差别的分离方法 1 、透析： 利用蛋白质分子不能透过半透 膜， 使蛋白