黄豆黄素诱导人胃癌AGS细胞凋亡机制的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 胃癌是一种常发生在人体消化系统上的恶性肿瘤，癌症发病率数据分析表明，每年胃 癌新增病例约为 100 万人。其中，我国胃癌每年新确诊病例约占全球发病病例的百分之五 十，对国民生命健康构成了严重危害。黄豆黄素（Glycitein ）作为一类主要的非营养素组 分普遍存在于大豆的种子、根、茎、叶及其他豆科植物中。黄豆黄素具有多种生物活性， 因其表现了良好的活性而受到各国学者关注。但其防癌抗癌作用机制及有效浓度尚未明确。 因此，本研究通过食品毒理学，分子生物学和细胞生物学等方法，以黄豆黄素作为研究对 象，并以 12 种人胃癌细胞作为体外研究模型，从细胞及分子水平上，揭示黄豆黄素对胃 癌细胞的毒性作用，对正常细胞的毒理作用，周期阻滞，诱导细胞凋亡信号传导途径及其 潜在的分子作用机制，为研制治疗胃癌的功能因子和开发新型抗肿瘤功能型食品提供新的 思路和理论依据。 本实验利用 Cell Counting Kit-8 （CCK-8 ）法进行检测黄豆黄素对 12 种人胃癌细胞的 杀伤作用以及对 4 种人正常细胞的毒理作用；通过 Hochest 33342/PI 双染色法、Annexin V-FITC/PI 双染法、JC-1 线粒体膜电位荧光染色法及流式细胞术检测黄豆黄素对人胃癌细 胞的诱导凋亡作用；通过流式细胞术、蛋白免疫印迹法检测黄豆黄素对人胃癌细胞内 DNA 相对含量和细胞周期相关蛋白表达量的调控作用；黄豆黄素对人胃癌细胞内凋亡相关蛋白 表达量的调控作用采用蛋白质免疫印迹法进行检测；运用蛋白质免疫印迹法测定黄豆黄素 对人胃癌细胞内 MAPK/NF-κB/STAT3 信号通路蛋白表达量的影响及三者信号通路相互间 调节作用；使用 DCFH-DA 活性氧荧光探针法、流式细胞术及蛋白质免疫印迹法测定黄豆 黄素对人胃癌细胞内活性氧水平及信号通路蛋白量的影响。 CCK-8 实验结果表明，黄豆黄素能够降低 12 种人胃癌细胞存活率，且呈剂量依赖性。 此外，黄豆黄素对人正常胃 GES-1 细胞、人正常肝 QSG-7701 细胞、人类正常肺 IMR-90 细胞和人类正常胚胎肾 293-T 细胞的杀伤作用均无明显的毒副作用，且明显低于阳性对照 5-FU 组。Hochest 33342/PI 双染色法和 Annexin V-FITC/PI 双染法结果表明，黄豆黄素处理 AGS 细胞后，细胞凋亡形态变化明显且凋亡比例不断增加。JC-1 线粒体膜电位荧光染色法 结果显示，黄豆黄素使 AGS 细胞内线粒体膜电位下降，通透性增加。此外，黄豆黄素能 够显著上调促凋亡蛋白 Bax 的蛋白表达量，减少抗凋亡蛋白Bcl-2 的蛋白表达量，Caspase-3 和 PARP 被活化，进而触发人胃癌 AGS 细胞内部凋亡途径。此外，黄豆黄素能够使得人胃 癌 AGS 细胞阻滞在周期的 G0/G1 期，并伴随有 cyclinD1、cyclinE、CDK2/4/6 蛋白的表达 I 黄豆黄素诱导人胃癌 AGS 细胞凋亡机制的研究 量下降，P21 、P27 表达量上升。此外，DCFH-DA 活性氧荧光探针法与蛋白免疫印迹法实 验结果表明黄豆黄素能够有效上调 AGS 细胞内活性氧水平，从而增加 AGS 细胞中 p-p38 和 p-JNK 的蛋白表达量，下调p-ERK 、NF-κB 和 p-STAT3 蛋白表达量，致使人胃癌 AGS 细胞发生线粒体依赖凋亡。 综合以上结果，黄豆黄素对 12 种人胃癌细胞具有杀伤作用，其具体作用机制可能是 黄豆黄素通过增加人胃癌 AGS 细胞内活性氧的累积，激活 MAPK 信号通路，抑制下游 STAT3 和NF-κB 信号通路，促使线粒体膜电位下降，改变凋亡相关蛋白表达量，激活Caspase 凋亡级联反应，最终诱导人胃癌 AGS 细胞发生线粒体依赖性凋亡，本实验结果旨在为研 制出一种安全有效的防治肿瘤功能因子提供新的思路和理论依据。 关键词：黄豆黄素，人胃癌细胞，细胞凋亡，细胞周期阻滞，MAPK/STAT