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第一章 现代药理学实验方法与技术简介 第一节 分子生物学试验方法与技术 分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标 记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、 cDNA 文库、随机 分子库技术、 外核基因在真核细胞中的表达、 转基因动物、 人类基因治疗等。 现将更为常用的技术介绍如下： 一、核酸分子探针的标记 标记核酸分子探针（ nucleic acid probe ）是 进行核杂交的基础， 根据核酸分子探针的来源及性质进行选择， 选择的基本 原则是具有高度的特异性， 探针选择直接影响杂交结果的分析。 根据检测对 象和目的不同， ，可选择不同的探针种类及标记方法。 ㈠ 探针种类 1．基因组 DNA 探针 是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸 探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子） ，避免使用内含子及其它非编 码序列。 2．cDNA 探针 与 mRNA 互补的 DNA 链称 cDNA ，是一种较为理想 的核酸探针，特异性较高。 3．RNA 探针 RNA 与 RNA 或 DNA 杂交体的探针稳定性， 特异性高。 4 ．寡核苷酸探针 人工合成寡核苷酸片段做探针， 可根据需要合成相 应序列。 ㈡ 标记物 常用的探针标记物有两类： 放射性同位素和非放射性同位素。 标记物的 检测具有高度灵敏性和特异性。 标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定 性。 其中放射性同位素是应用最多的探针标记物， 但易造成放射性污染， 多 数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有 32 3 35 P? P? S， 有时也用 14C,125I 或 131I 。 二、核酸分子杂交 （nucleic acid hybridiazation ） 是指具有一定同源序 列的两条核酸单链在一定的条件下， 按碱基互补配对原则形成异质双链的过 程。 核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术， 灵敏度高、 特异性 强，主要用于特异 DNA 或 RNA 的定性定量检测。 三、聚合酶链反应 （polymerase chain reaction ，PCR）是一种体外酶促 扩增特异 DNA 片段的方法。 传统的 DNA 扩增法是分子克隆法， 需经过 DNA 酶切、 链接、 转化等步骤构建含有目的基因的载体。 然后导入细胞中进行扩 增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。 PCR 技术灵敏度 1 高，特异性强，操作简便。 PCR 是本世纪分子生物学研究领域中最重要的 发明之一。 四、 cDNA 文库 是指以 mRNA 为模板，在反转录酶的作用下形成的 互补 DNA （complementary DNA,cDNA