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第七章 病毒检验技术 第一节 标本的采集与处理 第二节 病毒形态学检验技术 第三节 病毒的分离与鉴定 第四节 病毒的血清学诊断及其他快速诊断方法 第一节 标本的采集与处理 一、采集原则 （一）采集时间 早期或急性期 （二）采集部位 呼吸道标本：鼻咽拭子、咽漱液 肠道标本：直肠拭子、粪便 污染标本加青霉素、链霉素或杀灭真菌的抗生素 （三）采集方法 呼吸道标本：鼻咽拭子、咽漱液 肠道标本：直肠拭子、粪便（2-5g粪便于无菌容器，5-10ml保存液） 中枢神经系统标本：1-2ml脑脊液4℃保存 血液标本：5-10ml血液（肝素钠抗凝），做血清学诊断时取5ml不抗凝血，需采集双份血清 尿液标本：5-10ml中段尿 二、标本的运送与保存 （一）标本的运送 4℃下50%甘油盐水，尽快送检，4℃低温保存数h，-70℃长时间保存 （二）标本的保存 冻存液中加保护剂（甘油或二甲基亚砜）、Hank液或小牛血清等避免病毒失活 第二节 病毒形态学检验技术 一、光学显微镜检查 大型病毒或包涵体 腺病毒：核内嗜碱性包涵体 麻疹病毒：胞浆内、胞核内嗜酸性包涵体 （二）常用观察方法 负染色法 超薄切片法 免疫电镜法 负染色法 磷钨酸盐染液不能透过电子束，病毒在暗背景下呈现亮度 分辨率高 敏感性低，病毒量需大于106-107/ml 免疫电镜法 抗原、抗体特异性结合 电镜检查标本中的病毒，因病毒易与周围的结构成分混淆 为提高电镜的敏感性和特异性，用特异性抗体将标本残渣中的病毒包被，使病毒颗粒凝集后镜检 第三节 病毒的分离与鉴定 一、病毒的分离培养 （一）组织细胞培养 将离体的活组织块或分散的活细胞培养 器官培养：分离特殊病毒 组织块培养：分离特殊病毒 细胞培养：最常用  (3)传代细胞系 体外无限分裂，持续传代，多来自肿瘤细胞或二倍体细胞突变 染色体特征类似肿瘤细胞 常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2) 对多数病毒敏感，易传代，但不宜制备疫苗，且可能有内源性病毒 二、病毒在细胞中增殖的鉴定指标 （一）细胞形态的改变 1、细胞病变效应（CPE） 某些病毒在细胞内增殖时引起细胞发生特有的形态学变化（细胞变圆、变性、坏死、溶解、脱落） 不同病毒出现CPE的时间不同 2、多核巨细胞 包膜病毒 3、包涵体 狂犬病病毒 正常细胞 三、病毒数量与病毒感染性测定 （一）空（蚀）斑形成试验 将一定浓度的病毒悬液接种于单层细胞，病毒吸附细胞，覆盖融化的琼脂或凝胶，散在的单个病毒复制，产生局限性病灶，局部单层细胞脱落，染色后显示不着色的空斑 每个空斑由一个感染性病毒体复制形成，称空斑形成单位（PFU） 计数病毒数量：病毒悬液中的感染性病毒量以PFU/ml表示 是准确滴定病毒感染性的方法 （二）半数感染量（ID50）与组织培养半数感染量（TCID50） 50%感染量（ID50）或50%组织细胞感染量（TCID50） 病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%发生死亡或病变的最小量。 估计病毒感染的强弱程度，不能准确测定感染性病毒颗粒的数量 病毒悬液以10倍递次稀释法稀释为不同浓度，分别接种细胞、鸡胚或动物，一定时间后观察CPE、RBC吸附、鸡胚变化或动物病变 一般观察10-14天 一、病毒的血清学诊断 用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体，辅助诊断病毒病 中和试验 血凝抑制试验 补体结合试验 免疫荧光技术 酶联免疫吸附试验（ELISA）等 二、病毒的分子生物学检测方法 核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR） 基因芯片技术 三、病毒感染的快速诊断 (一)形态学检查 电镜和免疫电镜 光镜检查包涵体 (二)检查病毒抗原 免疫荧光、固相放射免疫测定、酶免疫技术 (三)检测特异性IgM抗体 (四)病毒分子生物学检测 * * 狂犬病毒胞浆内嗜酸性包涵体（Negri body） 巨细胞病毒核内嗜酸性包涵体 二、电子显微镜检查 透射电镜：病毒大小、形态、细胞内超微结构 扫描电镜：病毒表面结构、附属结构 （一）标本制备 浓缩方法 超滤法：分子筛过滤 超速离心法 接种细胞快速增殖法 免疫凝集法 常用于病毒分离的细胞 细胞种类 可分离的病毒 原代细胞 非洲绿猴肾细胞 人单核细胞 人胚肾、肺细胞 恒河猴猕猴肾细胞 HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6 腮腺炎病毒、腺病毒 ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV 二倍体细胞株 人胚肺成纤维细胞株 WI-38、MRC—5 CMV、VZV、鼻病毒 腮腺炎病毒、腺病毒 传代细胞系 Hela Hep-2 Ve