几种常的用生物活性测试的方法简介.pptVIP

几种常用生物活性 测试方法简介 CONTENTS 分子水平活性测试方法 2)细胞水平活性测试方法 总结 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 等温滴定量热法( Isothermal Titration Calorimetry,TC是近年来发展起来的一种 研究生物热力学与生物动力学的重要方法,它通过高灵敏度、高自动化的微量 量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线,原位、在线和无损 伤地同时提供热力学和动力学信息。 基本原理: Q=△HxVx[HG =△HxVx KIG] I+K, G △G°=- RTIn K △G=△H-T△So 注:H为受体(主体),G为配体(客体),K为结合常数 △G为 Gibbs自由能变化,△H为焓变,△S为熵变 Isothermal Titration Calorimetry (ITc) ITC仪结构示意图 ITC是一种热量连续变化的量热器。主 要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池) 和参比池、注射器和一台计算机组成 注射器同时具有搅拌作用,计算机控 制温度控制装置和信息反馈系统。 Aciabeis sisd 受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收,导致样品池温度的变化,参比池 始终保持在实验温度,反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化,每注 次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏 所需要的能量,峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。 Methods In Cell Biology, 2008, 84, 79 Isothermal Titration Calorimetry (ITc) ITC数据图 ference cell Semple cell 左图: 横坐标:时间纵坐标:热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 右图: 横坐标:滴定物与样品溶液的摩尔比纵坐标:滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线 Journal of Molecular Recognition. 2008, 21, 289. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC独特之处 样品用量小,方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ,生物样品最 小用量0.4ug,滴定池体积1.43ml 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟,并加上几分钟的响应时间。 操作简单。整个实验由计算机控制,使用者只需输入实验的参数,如温度、注 射次数、注射量等,计算机就可以完成整个实验,再由软件分析C得到的数据。 量热实验完毕的样品未遭破坏,还可以进行后续生化分析。 ITC的用途 获得生物分子相互作用的完整热力学参数,包括结合常数(K)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H)、摩尔结合熵(△S)、摩尔恒压热容(△Cp),和动力学参数 (如酶活力(Kcat)、酶促反应米氏常数Km)。 可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物- DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面 surface plasmon resonance, SPR 表面等离子共振(SPR)原理 + 等离子波:当金属受电磁干扰时,金属内部 的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力 消逝波:当入射光到达界面时并不是直的存在,电子不会在引力与斥力的平衡位置 接产生反射光,而是先透过光疏介质约 一个波长的深度,再沿界面流动约半个停下而向前运动一段距离,之后电子间存在 波长再返回光密介质,透过光疏介质的的斥力会追使已经聚集起来的电子再次离开 波被称为消逝波 该区域。由此会形成一种整个电子系统的集 体震荡,而库仑力的存在使得这种集体震荡 反复进行震荡,并以波的形式表现 surface plasmon resonance, SPR 表面等离子共振原理 光在棱镜与金属膜表面上发生全反射 现象时,会形成消逝波进入到光疏介 质中与介质中存在一定的等离子波相 How channel 遇时可能会发生共振。当消逝波与表 面等离子波发生共振时,检测到的反 Sensor chip with gold film 射光强会大幅度地减弱 Reflected SPR角:反射光完全消失的角 SPR角随金属表面折射率变化而变化 而折射率的变化又与金属表面结合的 分子质量成正比。 enscrgram 可通过SPR角的变化捕获生物反应过 程中生物分子之间相互作用的特异信 Time 号,对待测物质进行测定直接测量反 应平衡常数K,解离平衡常数Kd等 surface plasmon