分子生的物学实验.pptVIP

分子生物学实验 中南民族大学生命科学学院 实验教学中心 2006年3月 实验一植物基因组DNA的提取 实验二多聚酶链式反应( po lymerase chain reaction,PCR)基因扩增及琼脂糖凝胶 电泳检测 实验三植物总RNA的提取 实验四蛋白质印迹 实验一植物基因组DNA的提取 实验目的及背景 ■高等动物,高等植物的基因组相当宠大,如人类细胞基因组由30亿个 碱基对组成,果蝇基因组有1.4×108个碱基对,水稻基因组有 1.4×109个碱基对。真核细胞基因组中,约1万—1.5万个可 表达的结构基因,其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某 特定物种的基因组,包含了该物种生长,发育,繁殖等各项生理活动的 几乎全部信息量,因而对真核细胞基因组的结构,组成,以及表达调控 的研究是至关重要的,而研究的起点就是要获得纯度高一不含蛋白质 糖类、酚、氯仿等污染:得率好一以便有足够量用于分析;基因组相对 完整一一断裂的基因组以便用于以后PCR分析,RFLP分析,基因文库 的构建,基因探测等的研究。 真核细胞基因组在提取过程中一般有以 下几步,首先是机械法破细胞抽提;然后 去除蛋白质,糖类等细胞内杂质污染;最 后纯化出DNA,由于真核细胞基因组较 大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温 下进行,以最大限度地减少机械和化学作 用对DNA的剪切,从而获得相对完整的 DNA 十二烷基肌酸钠( sar kosy1)、十六烷基三甲基溴化铵 ( heady ltr i methy! ammomum br omi de,简称为CTAB)、 十二烷基硫酸钠( sod ium dodecy I sulfate,简称SDS) 等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使 核蛋白解聚,从而使DNA得以游离岀来。再加入苯酚 和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分 相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从 抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加 入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得 植物总DNA溶液。 三、实验材料水稻幼叶 四、主要试剂配方 2%TAB抽提缓冲溶液:CTAB4g Na|16.364g 1M Tr is-HC I 20mI( PH8. 0) 0.5 MEDTA8m,先用7 Om ddH20溶解,再 定容至200m灭菌, 冷却后0.2-1%2-巯基乙醇(400u1)氯仿-异 戊醇(24:1):先加96m氯仿,再加4m异戊 醇,摇匀即可。 五、实验步骤 1.DNA的提取 (1)2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 (2)取少量叶片(约1g)置于研钵中,用液氮磨至粉状 (3)加入0ou的2‰TAB抽提缓冲液,轻轻搅动; (4)将磨碎液分倒入1.5m的灭菌离心管中,磨碎液 的高度约占管的三分之二 (5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10min轻轻摇 动,40min后取出 (6)冷却2min后,加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管, 剧烈振荡2°3min,使两者混合均匀 (7)放入离心机中10000rpm离心10min,与此同时, 将600μ的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中 (8)10000rpm离心1min后,移液器轻轻地吸取上清夜, 转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动 30se,使异丙醇与水层充分混合至能见到D№A絮状物: (9)10000rpm离心1min后,立即倒掉液体,注意勿 将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上 (10)60sec后,直立离心管,加入720μ的75%乙醇及 80μ5M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使 沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中 (11)放置30min,使DNA块状物的不纯物溶 解 (12)10000rpm离心1min后,倒掉液体, 再加入800μ75%的乙醇,将DNA再 洗30min (13)10000rpm离心30sec后,立即倒掉液 体,将离心管倒立于铺开的纸巾上; 数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自 然风干或用风筒吹干) (14)加入50μ0.5×TE(含 RNase)缓冲 液,使DNA溶解,置于37℃恒温箱约 15h,使RNA消解; (15)置于-20℃保存、备用。 2.DNA质量检测琼脂糖电泳检测, 1 2 3 4 5 HindII 总DNA