（精选课件）病毒的细胞培养.pptVIP

六 细胞培养的实验步骤 1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养 * （1）取胚 选取9-11日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。 * （2）组织处理 用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀将鸡胚剪成碎块。 * （3）消化 用PBS液充分冲洗组织碎块2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37℃消化10分钟，每隔2-3分钟轻轻摇动一次。待组织碎块聚合成团，边缘毛样模糊时取出，轻轻吸取上层消化液，加适量DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散。 * （4）分装、培养 将细胞悬液移入细胞培养瓶中，在细胞培养瓶中加入到10ml DMEM，充分混匀，让细胞呈单个形式存在，最后将其放入恒温箱中培养。 * 2传代细胞的培养 （1）细胞的复苏 （2）细胞的传代 （3）细胞的换液 （4）细胞生长状况的观察 （5）细胞的冻存 * （1）细胞的复苏 概述 复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。 * 操作步骤 准备好培养瓶、培养液和离心管等放于超净工作台内。 从保存液氮或低温冰箱中冻存管（安瓶）的小袋或冻存盒内取出的冻存管（安瓶）应直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融化。 从37℃水浴中取出冻存管或安瓶，离心1000r×1min,用酒精消毒后开启，用滴管吸出上清液，注入培养液1ml充分混匀，转入刻度离心管制成细胞悬液后低速离心，除去上清液，必要时再重复用培养液洗一次。 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入CO2培养箱静置培养，次日更换一次培养液。继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。细胞复苏时细胞数可以做10－20倍稀释，接种密度以5×105 ／ml为宜。 * （2）细胞的传代 原理??? 在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 * 操作步骤 将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉 加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细胞从培养瓶壁上吹下来 然后进行传代 * 消化传代的步骤 * （3）细胞的换液 原理： 当细胞的量很少，未能铺满整个生长表面，但细胞培养液的pH值已经发生很大变化；或者是细胞形态很差等情况时，需要给细胞换液。 * 操作步骤 （1）吸弃或倒掉培养瓶内的旧培养液 （2）加入PBS溶液清洗细胞瓶五面 （3）加入足量的细胞生长液，放入37℃、5%CO2培养箱静置培养。 * （4）细胞生长状况的观察 原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相应的措施处理。 肉眼观察 显微镜观察 * （5）细胞的冻存 传代细胞应有充足的冻存储备。 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。 二则防止细胞因传的代次太多，造成细胞衰老或细胞发生变异。 * 细胞冻存方法 （1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法将细胞制成悬液并计数，8